五味子醇甲对KC介导的肝纤维化抑制作用的初步研究

                 作者：王洋, 戚好文，胡咏武, 王胜春 

【摘要】  目的: 观察五味子醇甲（SCH）对肝纤维化大鼠枯否细胞（KC）释放活性介质的影响.方法: 分离、纯化大鼠KC细胞并建立脂多糖 (LPS)诱导KC细胞释放细胞因子（TNF?α，IL?6, IL?8）模型；制备及采用I125放射免疫法分别测定正常对照组、LPS模型组及SCH组的细胞因子水平；酶谱法检测细胞培养上清谷草转氨酶(AST), 谷丙转氨酶(ALT)的变化. 结果: SCH治疗组可抑制KC细胞分泌TNF?α(21.2±6.3), IL?6(0.17±0.01), IL?8(0.8±0.1)等细胞因子（P＜0.05）. 结论: SCH甲具有治疗肝纤维化的作用.

【关键词】  五味子醇甲；脂多糖；枯否细胞；细胞因子；抑制

　　　【Abstract】 AIM： To observe the effect of schizandrin(SCH) on cytokines released by kupffer cells in rats with hepatic fibrosis. METHODS: Kupffer cells were separated, purified and induced to release cytokines (TNF?α, IL?6, IL?8) by lipopolysaccharide(LPS). Cytokines of control group，LPS group and SCH treatment group were prepared and separately measured by 125I radioimmunoassay. Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) of hepatocyte supernatant were determined with zymography.  RESULTS： SCH significantly inhibited kupffer cells from delivering TNF?α(21.2±6.3), IL?6(0.178±0.01), IL?8(0.8±0.1) (P<0.05). CONCLUSION： Schizandrin can be used to treat hepatic fibrosis.

　　【Keywords】 schizandrin; lPS; kupffer cell; cytokine; inhibiting

　　0  引言
   
　　中药治疗肝炎、肝硬化具有其独到之处，因此长期以来是该领域的研究热点. 五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实. 具有敛肺滋肾、生津敛汗、涩精止安、宁心安神的功效［1］. SCH（schizandrin，SCH）为五味子醇提取物，对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用, 在治疗急慢性肝炎方面具有显著疗效. 但五味子醇甲对肝硬变的防治作用目前尚未见报道. 已知细胞因子在肝硬变发生中起着重要作用, 为此本研究针对肝硬变的特点，进行了体外五味子醇甲对大鼠肝枯否细胞（kupffer cell，KC）分泌肿瘤坏死因子α (TNF?α), 白细胞介素?6 (IL?6)与白细胞介素?8(IL?8)等活性细胞因子影响的研究. 旨在初步揭示SCH抗肝纤维化的作用.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  精密称取1 mg SCH，加DMSO 0.1 mL（sigma公司）溶解后，用4 mL含100 mL/L小牛血清培养液混匀，过滤除菌，即为200 mg/L溶液. 受试药物浓度为100 mg/L（预实验证实）.

　　1.2   方法

　　1.2.1  枯否细胞分离与培养  参照［2］方法，取体质量150～200 g，SD雌性大鼠3只（第四军医大学动物中心提供），250 g/L乌拉坦麻醉后，小心游离摘取肝脏（勿使肝包膜破裂），置入Hank?s液的培养皿中反复冲洗3次，剥离肝包膜，剪碎肝脏，过220目细胞筛，细胞用无血清培养液冲洗，混悬后1000 r /min, 离心5 min，弃去上清；沉淀细胞用无血清培养液洗涤，1000 r/ min离心2次, 每次5 min，细胞重悬于200 mL/L小牛血清培养液中，混匀后滴加于不连续梯度密度分离液上(1.053, 1.058, 1.080)，5200 g（20℃）离心20 min. 小心吸取密度1.058以下分离液，收集的分离液3000 r/min离心10 min, 沉淀细胞用200 mL/L小牛血清培养液洗涤，3000 r/ min离心2次, 每次10 min，4 g/L台盼蓝染色判断活性. 细胞重悬于200mL/L小牛血清培养液中，调整细胞密度1×1011个/L后，接种于培养瓶内, 37℃, 50 mL/L CO2孵箱内培养，经反复传代纯化后开始试验.

　　1.2.2  建立脂多糖 (LPS)诱导KC细胞释放细胞因子（TNF?α，IL?6, IL?8）的模型  4组KC细胞培养于96孔培养板中，37℃, 50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中培养12 h使细胞贴壁，每组分别用100, 80, 60, 40 μg/L的脂多糖（lipopolysacchide，LPS，SIGMA公司）孵育6, 12, 18, 24 h，吸去培养液，用PBS洗涤细胞1次；每孔加浓度5 g/L的MTT染液20 μL（溶于PBS中，滤过除菌，4℃避光保存）于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中继续孵育细胞4～6 h；加入新鲜配制的DMSO溶解MTT 150 μL/孔，水平摇床上摇10 min，使还原产物充分溶解，酶标仪上570 nm波长下测定光密度值. 每试验点重复4孔，优选出LPS作用KC细胞的最佳浓度及培养时间，据此最佳条件建立LPS诱导KC细胞释放细胞因子的模型.

　　1.2.3  实验分组及各组细胞因子（TNF?α，IL?6，IL?8）检测  取24孔培养板2块，每孔加入8 mm×8 mm玻片1张后接种纯化KC细胞悬液1 mL（每mL含细胞数约1×108），置37℃，50 mL/L CO2孵箱内培养，待细胞长成单层后分设正常对照组、LPS模型组、SCH治疗组，每组8孔. 正常组、LPS模型组加完全培养液；SCH治疗组加入浓度为100 mg/L的供试液1 mL，继续培养24 h，弃去上清后正常组加完全培养液；LPS组、SCH治疗组各加60 μg/L LPS的完全培养液1 mL，继续培养8 h，收集各组细胞上清至-80℃保存，I125测定各组细胞培养上清中细胞因子TNF?α, IL?6及IL?8的含量.

　　1.2.4  SCH对细胞因子介导的肝损伤的作用  按“1.2.1”方法制备KC细胞，调整细胞密度1×1011/L，置双层培养小室下层，37℃, 50 mL/L CO2孵箱内培养，长至单层后进行实验. 取生长良好细胞分成3组：正常对照组、LPS模型组及SCH组. 正常对照组、LPS模型组. 制备方法同1.2.3. SCH组制备方法为生长良好KC细胞, 用SCH供试液（100 mg/L）培养. 培养12 h弃上清，正常对照组加完全培养液，LPS模型组和SCH组每孔各加60 μg/L LPS供试液1 mL，培养3 h后终止. 制备鼠肝细胞（HC）悬液，按密度1×1011/L加入上述各组培养小室上层内，每组6孔，每孔0.5 mL，继续培养8 h后取上清液测定谷草转氨酶(AST), 谷丙转氨酶(ALT).
   
　　统计学处理:  使用SPSS10.0统计分析软件，实验结果以 表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD?t检验， P＜0.05为差异具有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  不同浓度LPS 对KC细胞活性的影响  MTT结果显示使用浓度为60 μg／L的LPS孵育KC细胞培养12 h 时，KC活性最佳(图1).

　　图1  不同浓度LPS对KC细胞活性影响（略）

　　2.2  SCH对KC细胞分泌TNF?α，IL?6，IL?8的影响  与正常对照组相比，LPS模型组KC细胞培养上清中细胞因子水平升高(P＜0.05)，SCH组KC细胞培养上清TNF?α和IL?8水平较LPS模型组下降(P＜0.05, 表1).

　　表1  KC细胞上清中细胞因子的水平（略）

　　aP＜0.05 vs 正常对照；bP＜0.01 vs LPS模型.

　　2.3  SCH对肝细胞培养上清AST，ALT的影响  与正常对照组相比，LPS模型组HC细胞培养上清AST和ALT水平升高（P＜0.05），SCH治疗组HC细胞培养上清TNF?α和IL?8水平较LPS模型组下降（P＜0.05），接近正常对照组水平 (表2).

　　表2  复层培养条件下HC细胞上清中AST, ALT水平（略）

　　aP＜0.05, bP＜0.01 vs SCH. AST：谷草转氨酶；ALT：谷丙转氨酶；LPS：脂多糖；SCH：五味子醇甲.

　　3  讨论
   
　　现有研究表明在多种因素诱发的肝损害过程中，均有激活的肝枯否细胞的介导及参与. KC细胞释放TNF?α，IL和蛋白水解酶等细胞因子，是该过程中的重要病理机制. 高水平的TNF?α可以诱导肝细胞凋亡［3］与坏死，TNF?α尚能诱导KC产生自由基，对肝窦内的中性粒细胞具有趋化作用而进一步加重肝细胞损伤［4］. 此外，TNF?α又可诱导单核细胞和巨噬细胞产生IL?8和IL?6 ［5-7］. IL-6刺激肝细胞、枯否细胞分泌多种细胞因子，引发这些细胞因子的致纤维化作用. 在感染、局部缺血、创伤及其它肝组织内环境失衡条件下，IL?8的重要诱导剂TNF增高，导致IL?8产生增多，直接损害肝细胞和加速病情恶化.
   
　　SCH为五味子醇提取物，对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用［8］，但对肝硬变细胞因子的影响尚未见报道. 本研究首先建立脂多糖诱导大鼠肝枯否细胞释放细胞因子（TNF?α，IL?6,IL?8）模型，通过测定并比较正常组、LPS组和SCH治疗组的细胞因子，结果发现与正常对照组相比，LPS模型组KC细胞培养上清TNF?α和IL?8水平升高（P＜0.05)，表明KC细胞经适宜浓度（60 μg／L）LPS诱导12 h后活性细胞因子的分泌增加，从而建立了本研究所需的细胞模型. 另一方面，SCH治疗组KC细胞培养上清TNF?α和IL?8水平较LPS模型组下降（P＜0.05），IL?6有下降趋势，提示SCH干预能减少KC细胞活性因子的释放，但IL?6水平降低不具备统计学差异，可能与因子调控的不同步性及LPS作用KC时间和所选浓度（60 μg／L）有关. 在上述模型的基础上，进一步研究了细胞因子介导的肝细胞（HC）培养上清AST，ALT的变化. 结果是LPS模型组HC细胞培养上清AST和ALT水平高于正常对照组， 证实LPS诱导的KC释放活性介质确对体外培养肝细胞有损害作用. SCH治疗组HC细胞培养上清AST和ALT水平较LPS模型组下降，接近正常对照组水平，提示经SCH预处理的KC细胞具有抵抗LPS、减少肝纤维化因子损害及保护肝细胞的作用.
   
　　已有实验表明肝纤维化患者的纤维化程度改善与IL?6,IL?8血清水平降低成正相关［9］；Pena等［10］发现经过还原型谷胱甘肽治疗的肝纤维化患者血清中IL?6 和IL?8 水平明显下降；Sener等［11］研究指出银杏治疗胆梗阻大鼠肝纤维化时，相比于正常组，治疗组TNF?α水平明显降低. 本研究初步提示SCH通过抑制枯否细胞释放TNF?α，IL?6，IL?8来保护肝细胞及减少肝损害的作用. 鉴于肝硬化病变机制复杂，SCH对肝脏的保护作用有待深入探讨.

【】
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