中药夏枯草对甲状腺癌细胞NIS基因表达及摄碘率的影响

                 作者：张王峰, 付强, 赵华栋, 徐海峰，周润锁, 袁梦晖, 周飞华, 南菁    

【摘要】  目的： 探讨中药夏枯草对甲状腺癌细胞株K1钠/碘同向转运体(NIS)基因表达及摄碘率的影响，为夏枯草辅助放射性碘甲状腺癌提供依据. 方法： 分别以不同浓度(0, 20, 50, 100, 150, 200 g/L)的夏枯草处理体外培养的甲状腺癌细胞株(K1)，48 h后利用半定量RT?PCR检测细胞NIS mRNA表达，γ?计数仪检测细胞摄碘能力. 结果： 夏枯草浓度在0～100 g/L范围内，细胞NIS基因表达及摄碘能力随夏枯草浓度的增加而增加(P<0.05). 当夏枯草浓度达150～200 g/L时，增加后浓度与100 g/L浓度相比差别无统计学意义(P>0.05). 结论： 夏枯草可上调甲状腺癌K1细胞NIS基因表达，增强其摄碘率，而且这种作用在一定浓度范围内具有剂量依赖性.

【关键词】  夏枯草；甲状腺肿瘤；肿瘤细胞；RT?PCR；碘同向转运体；摄碘率

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of traditional Chinese medicine Prunella vulgaris on the expression of sodium iodide symporter (NIS) gene and radioiodide uptake in thyroid cancer cell line(K1), so as to evaluate the significance of traditional Chinese medicine Prunella vulgaris in the treatment of thyroid cancer with radioiodide. METHODS：The thyroid cancer cell line(K1) was treated with traditional Chinese medicine Prunella vulgaris at concentrations of 0, 20, 50, 100, 150, 200 g/L for 48 h. The expression level of NIS mRNA of K1 was determined by RT?PCR and its radioiodide concentration activity was measured by γ?counter. RESULTS： Traditional Chinese medicine Prunella vulgaris at the concentration between 0 and 100 g/L increased the expression of NIS gene and the radioiodide uptake of K1. There was no significant difference between 150-200 g/L and 100 g/L (P<0.05).CONCLUSION： Traditional Chinese medicine Prunella vulgaris could increase the expression of NIS gene and the activity of radioiodide concentration of thyroid cancer cell line(K1)in a dose?dependent manner．Traditional Chinese medicine Prunella vulgaris  may play a role in the therapy of thyroid cancer.

　　【Keywords】 Prunella vulgaris；thyroid neoplasms tumor cells；RT?PCR；NIS；radioiodide uptake

　　0  引言
   
　　中药夏枯草治疗甲状腺肿瘤有悠久，目前多种专利报道的抗癌中成药的主要成分也是夏枯草［1-3］. 临床治疗中，甲状腺癌对化疗药物不敏感，而放射性碘治疗分化型甲状腺癌疗效确切. 如何提高甲状腺癌细胞的摄碘率是目前研究的热点. 钠/碘同向转运体 (Sodium/Iodide Symporter，NIS)基因被认为与甲状腺细胞对碘的摄取有密切关系. 本研究以人甲状腺癌细胞系K1为研究对象，观察了夏枯草对甲状腺肿瘤细胞钠/碘同向转运体NIS基因表达及摄碘率的影响，从而探讨夏枯草能否增加甲状腺癌对碘的摄取以起到增加放射性碘对甲状腺癌的疗效.

　　1  材料和方法

　　1．1 材料  NU?2500型CO2培养箱（美国HUAIRE公司）；GU?20低温高速冷冻离心机（江苏太仓医疗仪器厂）；SW?CJ?IF净化工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；人甲状腺乳头状癌细胞系K1（欧洲细胞培养中心），于饱和湿度、37℃，50 mL/L CO2的条件下进行传代培养；Na125I（成都中核高通同位素有限公司生产，放射化学纯度99.7%无载体 pH 8.0）；DMEM培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程有限公司）；Trizol（Gibco公司）；反转录试剂盒（Promega公司）；PCR酶为 rTaKaRa(宝泰克公司)；PCR反应引物（北京奥科生物技术公司）. NIS上游引物序列为5′?tggttaagggaccggaagacatc?3′，下游引物序列为5′?agttgcctactgcaatctacaagg?3′，产物片段为342 bp. GAPDH（3?磷酸甘油醛脱氢酶），上游引物序列为5′?AGGTCCACCACTGACACGTT?3′，下游引物序列为5′?GCCTCAAGATCATCAGCAAT?3′，产物片段为310 bp. 夏枯草配制：40 g夏枯草加水400 mL，煮沸30 min并过滤除渣，熬制浓缩液定容至40 mL，滤液浓缩浓度为1 g/mL，经120℃ 30 min高压灭菌后，用直径为22 μm的微孔滤膜正压过滤，使用时用DMEM培养液稀释至所需的不同浓度梯度.

　　1.2   方法
 
　　1.2.1  细胞培养  取对数生长期的细胞以1×108个/L密度接种于培养瓶中，24 h后悬浮细胞贴壁，然后换以新的培养液加入不同浓度夏枯草（0，20，50，100，150，200 g/L）. 作用48 h后收集细胞进行相应指标的检测.

　　1．2.2  RT?PCR检测 NIS mRNA的表达  取1×108个/L细胞，加1 mL Trizol裂解液于培养瓶中，用细胞刮勺将细胞充分刮下，转入1.5 mL离心管， 室温5 min，加200 mL氯仿，混匀，室温5  min，4℃离心，8000 r/min，15 min，将上清转入新管，加5 mL异丙醇，混匀，室温10 min，4℃离心，8000 r/min，10 min. 去上清，加1 mL 750 mL/L 乙醇(DEPC 水配制)，4℃离心，8000 r/min，5 min. 去上清，沉淀物加去离子水溶解，读取A260nm测量RNA浓度. 每个样品取1 μg RNA进行反转录，于20 μL反应体系中加入oligo dT(500 mg/ L)1 μL，细胞总RNA 1 μg，dNTP（2．5 mmol/L）4 μL，加水至12  μL， 65℃， 5 min. 冰浴2 min，短时离心后加入5×反应缓冲液4 μL， 0.1 mol/ L  DTT 2 μL， RNase OUT 重组核糖核酸酶抑制剂(40 U/μL) 1 μL， 混匀， 42℃， 2 min，加反转录酶1 μL (200 U/μL)，42℃， 50 min， 70℃，15 min后终止反应. PCR 扩增在25 μL体系中加入10×反应缓冲液2.5 μL，dNTP (2.5 mmol/ L）4 μL，模板(cDNA) 2 μL， 上游引物与下游引物各2 μL (10 μmol/ L)， PCR Taq 酶1 U， 加水至25 μL. PCR 条件：以GAPDH基因表达产物为内参照进行半定量RT?PCR，NIS循环参数为94℃预变性5 min，继以94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后72℃延伸10 min. GADPH循环参数为94℃预变性5 min，继以94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环后72℃延伸10 min. 各取10 μL PCR反应液在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，EB染色后照相. Kodak  Digital Science ID软件系统扫描，测定光密度值并NIS／GAPDH光密度比值. 其结果为3次重复实验结果.

　　1．2．3  γ?计数仪检测细胞摄碘能力  夏枯草作用48 h后收集细胞于小试管，调整细胞数，使每管的细胞个数为1×106个. 离心弃上清，用PBS清洗两次. 向每个试管加入l mL含125I的HBSS溶液 (含37 kBq 125I)［10］，将试管于37℃放置1 h，离心去除上清液，用HBSS洗两次. 于γ?计数仪检测细胞的摄碘水平.
   
　　统计学处理  采用SPSS10．0统计软件. 数据以x±s表示. 计量资料比较采用t检验和方差分析处理. P<0．05为差异有统计学意义.

　　2  结果

　　2．1  RT?PCR检测NIS mRNA  经不同浓度的夏枯草处理48 h后，K1细胞NIS mRNA水平上调(图1). 当夏枯草浓度在0～150 g/L范围内，基因表达随夏枯草浓度的增加而增加(P<0.05). 当夏枯草浓度达200 g/L时，NIS mRNA的增加与前一浓度相比差别无统计学意义(P>0.05).

 
　　A：NIS的表达；B：GAPDH的表达. M：marker.

　　图1  RT?PCR分析NIS基因在不同浓度夏枯草作用下的表达（略）

　　2．2  γ?计数仪检测细胞摄碘能力  20 g/L的夏枯草作用后细胞摄碘能力便出现增强，随着夏枯草浓度的增加细胞摄碘能力逐渐增强(P<0.05)，但150 g/L浓度组与100 g/L浓度组相比增加不明显(P>0.05，图2).

　　图2  夏枯草对甲状腺癌细胞摄碘能力的影响（略）
　　
　　3  讨论
   
　　研究报道单味药夏枯草经水煎醇提法制成的夏枯草注射液对胃癌、大肠癌的体内外实验表明夏枯草具有一定的抗肿瘤作用，可以改善病情，提高生存质量［4-5］.

　　钠/碘同向转运体(NIS)是存在于甲状腺滤泡细胞基底侧细胞膜上的一种糖化膜蛋白，即所谓的“碘泵”，其功能主要是将血液中的碘摄取入甲状腺滤泡细胞内，以便合成甲状腺激素. 1996年，Dai等［6］首先从FPTL?5细胞的cDNA文库中克隆出鼠NIS基因，同年，Smanik等［7］用针对鼠NIS cDNA序列的引物，经逆转录?聚合酶链反应法扩增出人类NIS(hNIS)的细胞cDNA片段，随后从人甲状腺细胞cDNA文库中克隆出hNIS. hNIS基因位于19号染色体上，整个编码区由15个外显子及14个内含子构成，其开放阅读框架为1929个核甘酸，编码643个氨基酸残基［7］. 研究发现［8］，在不同病理状态下，甲状腺组织NIS基因表达存在明显差异. 自主功能性腺瘤、Graves病和结节性甲状腺肿患者NIS的表达增加. 而在甲状腺癌组织中，NIS的表达一般均低于正常甲状腺组织. Franco等［9］利用RT?PCR方法比较了正常甲状腺组织与甲状腺癌组织中NIS基因的表达，结果显示，在甲状腺癌组织中，NIS基因的表达普遍低于正常甲状腺组织. 甲状腺癌组织NIS基因的降低导致其摄碘能力的下降.
   
　　报道中药能逆转肿瘤细胞的恶性表型，中药及其配伍对多种肿瘤细胞均具有一定的诱导分化作用［10］. 本课题结果显示经一定浓度的夏枯草刺激后，甲状腺癌细胞系K1 NIS基因表达水平及摄碘能力较对照组明显提高. 因此，我们认为K1细胞NIS基因表达、摄碘能力的提高是夏枯草诱导细胞分化的结果.
   
　　甲状腺癌分化程度越高，摄碘能力越强. 由于乳头状甲状腺癌细胞具有一定的摄碘能力，因此利用放射性碘可进一步去除术后的残余灶及转移灶，从而大大改善甲状腺癌患者的预后. 但甲状腺癌摄碘能力低于正常甲状腺组织限制了放射性碘的临床应用. 本实验结果显示，甲状腺癌细胞株K1经夏枯草处理后，NIS基因表达上调、细胞的摄碘能力增强，这一实验结果为放射性碘治疗甲状腺癌提供了新的思路. 若能够通过应用夏枯草的诱导分化作用，诱导NIS基因的表达，促进甲状腺癌细胞向成熟阶段分化，恢复或提高其摄碘能力，然后再结合放射性碘的联合治疗模式，则可能获得满意的临床效果. 但本实验是建立在体外细胞培养的基础上得出的结论，缺少体内研究结果的证实. 其次，夏枯草诱导分化的机制尚不清楚，仍然处于实验研究阶段，缺乏进一步的临床研究. 今后应当进一步加强夏枯草诱导分化的体内的研究与临床观察，发掘中药夏枯草在肿瘤的治疗中作用.

【文献】
  　　［1］ 齐 杰，齐迎新．一种抗癌药物及其制备方法［P］．发明专利申请公开说明书：CN 1380089 CN 02117305．2，2002．

　　［2］ 蔡绪旺．一种抗癌中药胶囊制剂［P］．中国发明专利申请公开说明书：CN 1742866，2006．

　　［3］ 李光淳．一种抗癌药及制备方法［P］．中国发明专利申请公开说明书：CN 1733275，2006．

　　［4］ 王 琨，董惠芳，章晓鹰，等. 夏枯草对SGC?7901细胞的影响［J］．上海医学检验杂志，2000，15(5)：305-306.

　　［5］ 王文海，周荣耀，倪爱娣，等. 夏枯草注射液为主治疗中晚期胃、大肠癌30例临床观察［J］. 山西中医，2003，19 (3)： 24-26.

　　［6］ Dai G，Levy O，Carrasco N，et al. Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter［J］．Nature，1996，379：458-460．

　　［7］ Smanik PA，Ryu KY，Theil KS，et al. Expression，exon?in?tron organization，and chromosome mapping of the human sodium iodide symporter ［J］．Endocrinology，1997，138：3555-3558．

　　［8］ Deleu S，Allory Y，Radulescu A，et al. Characterization of autonomous thyroid adenoma：metabolism gene expression and pathology［J］．Thyroid，2000，10：131-140.

　　［9］ Franco A，Diego R，Martin S，et al. Iodide symporter gene expression in human thyroid tumors［J］．J Clin Endoc Finol Metab, 1998, 83：2493-2496.

　　［10］ 韩金凤，吴雄志. 扶正中药诱导肿瘤细胞分化研究进展［J］. 河北中医，2006，28（5）：391-392.