盐酸青藤碱抗肾间质纤维化的实验研究

【关键词】  减轻肾损害

    摘 要  目的:探讨盐酸青藤碱在肾间质性纤维化中的作用及其发生机制，为临床上进一步防止肾小球和肾小管间质纤维化提供一些借鉴。方法:采用小鼠单侧输尿管结扎法诱导肾间质纤维化的动物模型，用盐酸青藤碱治疗，并设对照组（病理组）、假手术组、治疗组，检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、血清层粘连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）的含量，免疫组化法检测组织转化生长因子β 1 （TGF-β 1 ）的表达并进行肾脏病的观察。结果:3组比较，对照组BUN、SCr明显高于治疗组（P<0.01），略高于假手术组，但统计学比较无显著性差异（P>0.05）;治疗组TGF-β 1 及FN均明显低于对照组、假手术组（P<0.01）;LN亦较对照组、假手术组低（P<0.05）。对照组、假手术组肾小管结构消失，代之以弥漫性纤维组织增生及单核细胞浸润;治疗组虽也肾小管萎缩、扩张，但病变较轻，绝大多数肾小管结构尚存，炎性细胞浸润也多呈局灶样分布。结论:盐酸青藤碱能降低BUN、SCr、FN、LN的含量以及TGF-β 1 表达，抑制间质纤维化，减轻肾损害，从而延缓肾脏疾病的。

    关键词  肾间质性纤维化;层粘连蛋白;纤维连接蛋白;组织转化生长因子-β 1

    大量动物实验和人类肾小球疾病临床病理研究发现肾小球疾病的发展和预后与肾小管、肾间质病变的严重程度密切相关，据多因素分析表明，肾小管及肾间质纤维化是决定肾衰竭进展的最重要影响因素，也是大部分肾小球疾病发展的共同最终通路 ［1］ ，有报道 ［2］ :在肾小球疾病的慢性进展中，肾小球滤过率的下降速率与肾小管、间质病变程度的关系更密切。因此，临床寻找有效药物阻止肾间质纤维化，延缓肾功能进展有重要意义，本实验旨在探讨中药盐酸青藤碱抗肾间质纤维化的作用机制。

    1 材料与方法

　　1.1 实验材料

    1.1.1  动物:雄性Wister大鼠40只，体重180g～200g，由同济医大学动物实验中心提供。

    1.1.2  药物:湖南正清制药集团股份有限公司生产正清风痛宁缓释片。

    1.1.3  试剂:LN试剂盒购于上海海军医学研究所生物技术中心，TNF-β 1 免疫组化染色试剂盒，购于北京中山生物技术有限公司。

    1.1.4  仪器:722分光光度计、HPISA-1000全自动图象分析系统。

　　1.2 实验方法

    1.2.1  分组:大鼠适应性地喂养7d，然后随机分

    为3组，对照组（不施加任何药物的病理组）、假手术组、治疗组，每组各15只。

    1.2.2  造模:三组大鼠均行右侧输尿管结扎术按照 ［4］ 进行。

    1.2.3  治疗:造模第2d，给假手术组小鼠每日按10mL/kg体重生理盐水灌胃，直至治疗结束，治疗组选用湖南正清制药集团产正清风痛宁缓释片按每日30mg/kg体重给小鼠灌胃，连续3W。

    1.2.4  观察指标及标本采集:给药3W后，各组大鼠眼球后静脉丛取血，血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、测血清层粘连蛋白（LN）、组织转化生长因子-β 1 （TGF-β 1 ），然后处死大鼠，取出右肾，生理盐水冲洗，除去非肾脏组织，置于10%的甲醛液中固定，以备免疫组化及光镜观察。

    1.2.5  结果判定及记录:肾小管间质病理改变的标准 ［3］ :肾小管扩张、萎缩，间质纤维化及炎细胞浸润，肾小管间质损害程度参照国内唐政分法分3级:Ⅰ级小管间质病变散在轻微，范围<15%;Ⅱ级小管病变呈灶性或小片状分布，范围≥15%，<50%;Ⅲ级小管病变呈片状或弥漫分布，范围≥50%。

    1.3 统计学分析

    计量资料均以x±s表示，采用方差分析，以P<0.05为有统计学意义。

　　 2 结果

    2.1 各组大鼠血清BUN、SCr、FN、LN以及TGF-β 1 的含量 （见表1） 表1 各组大鼠血清BUN、SCr、FN、LN以及TNF-β1 的含量 注:与对照组比较*P<0.05，**P<0.01;与治疗组比较△P<0.05，△△P<0.01;对照组与假手术组比较BUN、SCr、FN、LN以及TNF-β1 的含量均无明显差异P>0.05。 由表1知血BUN、SCr进行3组比较，对照组BUN、SCr明显高于治疗组（P<0.01），略高于假手术组，但统计学比较无显著性差异（P>0.05）;治疗组FN及TGF-β 1 均明显低于对照组和假手术组TGF-β 1 、FN（P<0.01）;LN亦较对照组、假手术组低（P<0.05）。

    2.2 各组动物肾小管间质纤维化程度 （见表1） 表2 各组动物肾小管间质纤维化程度

    组别 例数 肾小管间质纤维化的损害程度Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级对照组 15 1 6 8假手术组 15 3 7 5组 15 8 4 3由表2可知治疗组肾小管间质纤维化的程度于对照组和假手术组比较差异明显（P<0.05）。

　　 3 讨论

    肾小管间质纤维化是肾脏疾病进展至终末期的一种共同病理表现 ［4］ ，肾小管间质纤维化造成肾小球滤过率下降是通过以下三条途径 ［5，6］ :①间质纤维化使小管间毛细血管狭窄，血管阻力增加，致肾小球血流量下降;②肾小管，尤其是近端小管萎缩必然损伤肾小管功能，通过球管反馈机制影响肾小球的某些功能，如肾小球的滤过率（GRF）;③肾小管间质纤维化改变可以直接引起小球硬化或纤维性新月体病变。小管间质纤维化不仅与间质成纤维细胞增生并转变为肌纤维母细胞有关，而且与细胞外基质（ECM）增多及降解减少有关，此外还与细胞凋亡等有关。而生长因子、某些血管活性物质、细胞因子等参与了上述成纤维细胞的增生、转 化及ECM增多的过程。TGF-β 1 是一种多功能细

    胞因子，是导致纤维化的重要生长因子 ［7］ ，①可以促进ECM的合成，抑制ECM的降解;②抑制基质降解酶的合成;③提高ECM受体的表达;④激活肾间质成纤维细胞并使其增生。LN是一种ECM，广泛存在于血液与间质中，测定其在血清中的含量可间接表明纤维化程度。本实验表明盐酸青藤碱（正清风痛宁缓释片）能降低LN的浓度，减少TGF-β 1 的表达。故推断盐酸青藤碱是通过减少致纤因子的形成，促进ECM降解，来达到抗间质纤维化的作用。

    综上所述，我们认为盐酸青藤碱能显著抑制肾间质纤维化，降低BUN、SCr、FN、LN的含量，抑制TGF-β 1 的产生，从而可作为临床上有效阻止肾间质纤维化，显著延缓慢性肾衰竭而使用的药物。

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    ［2］ Sharma AK，Mauer M，Kimy，et al.Interst it ial fibrosis in ob-structive nephropathy.Kidney Int，1993，44:774～788.

    ［3］ 王亚平，李伯祥，张雪光，等.α-平滑肌肌动蛋白在大鼠肾间质损伤时的表达及红景甙的保护作用.中华肾脏病杂志，2000，6（2）:118.

    ［4］ Gonalez Cuadrado S，lorz C，Moral RG，et al.Agonetic anti―Fs antibodies induce glomeruler cell apoptosis in mice in vivo，Kidney Int 1997，51:1739～1746.

    ［5］ 文晓彦，郑法雷.肾小管上皮细胞转分化在肾间质纤维化中 的作用.中华肾脏病杂志，1999，6:386～387.

    ［6］ 郑法雷.慢性肾功能衰竭进展的机制与防止.中华肾脏病杂 志，1998，37（2）:204～206.

    ［7］ Vijay k，Sharma A，Roxana M，et al.Intragraft TNF-β 1 Mrna:A correalate of interstitial fibiosiis and chronic allograft nephropathy.Kid- ney Int，1996，48（49）:1279.