小鼠促进骨髓抑制恢复相关因子IL?7基因的识别与克隆
作者：沈娟,胡耀华,邵红伟,肖兰凤
【摘要】 目的 寻找促进骨髓抑制恢复的相关细胞因子，进行骨髓抑制时基因表达差异分析，并对表达上调较大的细胞因子进行克隆验证。方法 尾静脉注射5?Fu构建小鼠骨髓抑制模型，运用基因芯片方法分析正常小鼠与骨髓抑制模型第0，3，7，11，14天的基因表达差异，针对表达上调较大的鼠IL?7基因设计引物，以RT?PCR克隆其编码序列，并构建phCMV/IL?7真核表达载体。结果 得到一组符合促进骨髓抑制恢复细胞因子特点的基因，其中细胞因子IL?7表达量升高30倍。结论 IL?7符合促进骨髓抑制恢复细胞因子的特点，为研究骨髓抑制恢复的新方案奠定了基础。
【关键词】 基因差异表达；IL?7；基因克隆；骨髓抑制
Abstract:Objective To find the cytokines that antagonized myelosuppression, and analyze gene expression in myelosuppressed mice and confirm remarkable upregulation of gene expression. Methods The myelosuppressed mice model was made by injection of 5?Fu in tail veils. The gene differential expression in day 0, 3, 7, 11 and 14 respectively were analyzed with genechip. Specific primers of IL?7 which rose remarkably was designed to clone its full?length coding sequence (CDS) by RT?PCR, and then the eukaryotic vector phCMV/IL?7 was constructed. Results A group of cytokines that might play positive regulatory roles in suppression and regeneration of hematopoiesis were found. The expression level of IL? 7increased by 30 times compared with the normal control. Conclusions IL?7 was a potential upregulating cytokine, and might be clinically used for myelosuppression.
Key words:gene differential expression; IL?7; gene cloning; myelosuppression
癌症是当今人类生命的一大杀手，而化学和放射治疗以及许多其他抗肿瘤治疗方法，都是针对快速分裂的细胞，因而主要副作用是令同样快速分裂的血细胞前体——造血干细胞受抑制，称为骨髓抑制。它可导致贫血、抗感染能力下降（免疫抑制）等不良反应，从而严重影响肿瘤的治疗效果。在骨髓移植恢复中，骨髓抑制恢复造血刺激因子在血象调节中起着至关重要的作用，恢复的正刺激因子在骨髓抑制时表达均应激升高，后随着骨髓恢复降低至正常表达水平，寻找骨髓抑制恢复中的关键因子意义重大。
作为白细胞介素家族成员之一，1989年白细胞介素?7被发现并命名。它全长1 589 bp，包含6个外显子（531 bp）、相应的内含子、5′和3′非翻译区；经过转录、翻译、切掉信号肽、修饰加工，形成成熟的含152个氨基酸的IL?7蛋白质，是相对分子质量为25 kDa的糖蛋白［1］。IL?7是一种多效细胞因子, 具有广泛的免疫效应，在T细胞的生长、存活及分化方面有重要作用［2］，同时有潜在趋化性质, 介导单核细胞参与炎症反应。近几年发现IL?7在多方面均发挥很大的潜在价值，在慢性粒细胞白血病［3］、抗肿瘤［4］、抗HIV病毒感染［5］、急性冠脉综合征［6］等病理方面均有显著作用。
本实验室经大规模基因表达差异分析发现，IL?7基因在小鼠骨髓抑制模型中表达明显升高，可能是自体促进骨髓抑制恢复的因素之一。在正常小鼠中，IL?7由于表达量较低，不易克隆。但在骨髓抑制模型小鼠的骨髓组织中克隆得到了IL?7基因，验证了IL?7基因上调，然后将其构建到真核高效表达质粒phCMV中，为进一步验证其在骨髓抑制恢复方面功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料
大肠杆菌DH5α和phCMV真核表达载体由本实验室保存，SPF级雄性8周龄BALB/c小鼠购自上海中科院动物所，体质量（20±1）g，M?MLV反转录试剂盒购自Promega公司，Taq plus酶、Trizol、限制性内切酶EcoR I、Xho Ⅱ购自Fermentas公司，RNA抽提试剂盒购自Qiagen，凝胶纯化试剂盒、质粒提取试剂盒为Omega公司产品，上、下游引物由Invitrogen公司合成。
1.2 方法
1.2.1 尾静脉注射5?FU造成骨髓抑制模型
采用尾静脉一次性注射5?FU，注射量为250 mg/kg（化疗的亚致死剂量），造成小鼠骨髓抑制模型，小鼠外周血细胞及骨髓细胞数下降再恢复，约14 d为1周期，于第0，3，7，11，14天各取6只小鼠计数外周白细胞数及骨髓细胞数。
1.2.2 基因芯片及芯片分析
提取正常小鼠及骨髓抑制模型小鼠第0，3，7，11，14天的骨髓腔细胞交由上海晶泰生物技术有限公司制作生物基因芯片，采用小鼠cDNA芯片（Affymetrix，Code number：Mouse430A）和小鼠EST芯片（Affymetrix，Code number：Mouse430B），每块芯片上有约2万个基因或EST，与骨髓细胞抽提得RNA进行杂交，并完成基因芯片数据处理工作——基因表达谱分析及功能分类分析。
1.2.3 引物设计
根据NCBI提供的鼠IL?7mRNA序列设计引物，扩增505～1 145 bp包含编码序列（548～1012）由上海英骏生物技术有限公司合成为
sense： 5′? CC CTCGAG TGCAGTCCCAGTCATC ?3′ （XhoⅡ的酶切位点）；antisense：5′? CGGGAT CCTCATACCTCACTGTAGATTTC ?3′ （BamH1的酶切位点）。
1.2.4 总RNA提取
5?Fu注射后第7天骨髓抑制模型小鼠，收集约1×107个小鼠骨髓细胞于DEPC处理的1.5 mL EP管中，再加入1 mL Trizol液从中提取总RNA。经电泳鉴定，比色法测定RNA的纯度和含量，置-70 ℃ 下备用。
1.2.5 反转录成cDNA
取1 μg骨髓细胞RNA逆转录得模板cDNA，步骤参照产品说明书。
1.2.6 鼠sIL1ra的扩增
扩增体系：模板1 μL、5 μmol/L引物各2 μL、1 U Taq酶、buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTP 0.5 μL、用ddH20补足至25 μL。循环参数：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸25 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。
1.2.7 克隆载体phCMV?IL?7的构建
扩增产物经胶回收纯化后，与phCMV载体按最优体系4 ℃连接16 h，连接产物转化感受态DH5α菌，铺于含Amp的LB平板上，以菌落PCR鉴定后进行测序。测序工作由Invitrogen公司完成，所得序列与GenBank中的IL?7基因进行比对。
1.2.8 数据分析
各分组所得计量数据采用均数±标准差(±s)表示，以SPSS10.0软件处理数据。
2 结 果
2.1 小鼠骨髓抑制模型的建立
由图1可见，在第0,3,7,11和14天的WBC（白细胞）和BMC（骨髓细胞）的计数是呈先下降后上升的趋势，这是由于给予大剂量5?Fu产生的骨髓抑制。小鼠尾静脉注射亚致死剂量造成骨髓抑制模型成功。
2.2 小鼠骨髓抑制模型基因芯片差异表达分析结果
基因芯片共检测12 152条基因，小鼠cDNA芯片结果发现小鼠骨髓先上升再下降的有2 486条（见图2），第7天达高峰时比正常水平上调表达2倍以上的基因有1 185条；第7天达高峰时比正常水平上调表达10倍以上的基因有65条；反之，小鼠EST芯片结果发现第7天达高峰，比正常水平上调表达2倍以上的EST有482条；反之，先下降后上升的则有443条（数据未列出）。
IL?7在正常小鼠中2个探针所侦测到的表达量探针荧光信号值见表1，图3。上调表达约30倍之多，结合白介家族分析，IL?7为其中重要的骨髓抑制恢复造血刺激因子。表1 两组IL?7探针的表达量（略）
2.3 IL?7基因克隆
分别提取正常小鼠及骨髓抑制模型小鼠总RNA，经电泳与比色法检验符合要求，分别取1 μg RNA进行反转录，将IL?7的PCR产物于1 %琼脂糖凝胶上电泳检验，在640 bp 处有一明显条带, 与预期目的带大小一致（见图4）。结果可知健康小鼠骨髓环境中IL?7表达量较低，而骨髓抑制小鼠IL?7表达量较高。
割胶回收纯化后，经酶切与phCMV载体连接，并转化大肠杆菌DH5α。从转化后平板上随机挑取数个菌落进行PCR鉴定（见图5）。
将阳性菌落送交公司测序，结果经Genebank比对后鉴定为IL?7(X07962)，为后继功能验证试验奠定基础。
3 讨 论
放化疗的主要副作用是骨髓抑制，而骨髓抑制的恢复依靠的是骨髓再生，其基础就是造血干细胞。造血干细胞是具有多能性维持和分化潜能的细胞［7］。将来自小鼠cDNA芯片的结果按它们在生物体内分子的功能进行分类分析后（分析工具可以从网站免费获得），由此获得了一些与HSCs扩增有关的重要基因，以及其他一些已经报道的相关基因，如骨形成蛋白（bone morphorge?netic protein,BMP）家族基因［8］、胰岛素样生长因子（insulin?like growth factor, IGF）基因［9］、锌指蛋白家族基因［10］等1 000多条已知基因，均与它们已知的功能以及在HSCs扩增过程中变化趋势一致，这提示芯片结果可能很接近实际情况；而且还得到了一些与骨髓抑制后造血再生有关的未知基因，其中有12条功能尚不清楚，但序列已知的分泌肽基因的cDNA，在这个过程中表现为很明显的先上调后下调的现象，非常符合造血正调节细胞因子的特点。有理由相信成功地得到了一张骨髓抑制后造血再生时HSCs在体内扩增时基因表达的“全景图”。
IL?7可以刺激前B细胞的生长且抗凋亡，促进γ和T细胞分化, 促进淋巴细胞生成，对T细胞发育、增殖及稳态调节起关键作用，还是多潜能干细胞和髓系前体细胞的移动因子, 可促进骨髓组织生成［11］。在骨髓抑制造血系统再生时，IL?7作为造血再生的正调节因子因素自发表达上调若干倍，刺激造血再生，从干细胞到前体细胞，再从前体细胞到终末细胞的分化，且有助于免疫系统重建，防止由此带来的免疫抑制的发生。目前骨髓抑制的临床方案主要应用细胞因子， 如G?CSF、 EPO、 IL2～6等。根据本文的研究结果，IL?7也可以做为潜在的治疗骨髓抑制的细胞因子继续深入研究，如体外骨髓长期培养、骨髓造血干/祖细胞集落形成实验、骨髓造血干细胞连续移植等。治疗骨髓抑制的药物将不断出现，促进骨髓造血再生的方案也将不断完善，在肿瘤临床治疗方面发挥重要作用。
【文献】
［1］NAMEN A E, LUPTON S, HJERRILD K, et al. Stimulation of B?cell progenitors by cloned murine interleukin?7［J］. Nature, 1988, 333:571-573.
［2］HOFMANN S, ETTINGER R, ZHOU Y J, et al. Cytokines and their role in lymphoid development differentiation and homeostasis ［J］. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 2002, 2:495-506.
［3］BERTAGNOLLI M, HERRMANN S. IL?7 supports the generation of cytotoxic T lymphocytes from thymocytes multiple lymphokines required for proliferation and cytotoxicity［J］. Cytotoxicity,1990, 145(6): 1706-1712.
［4］王炯, 孙明, 董承红, 等. 血管生成抑制素和IL?7联合治疗的肿瘤抑制效应［J］. 肿瘤, 2001, 5(21):318-322.
［5］SCHMITT N, CHENE L, BOUTOLLEAU D, et al. Positive regulation of CXCR4 expression and signaling by interleukin?7 in CD4+ mature thymocytes correlates with their capacity to favor human immunodeficiency X4 virus replication［J］. Journal of Virology, 2003, 77(10):5784-5793.
［6］DAMAS J K, WAEHRE T, YNDESTAD A, et al. Interleukin?7 mediated inflammation in unstable angina: Possible role of chemokines and platelets［J］. Circulation, 2003, 107:2670-2676.
［7］WAGER A J, SHERWOOD R I, CHRISTENSEN J L, et al. Response to comment on “Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells” ［J］. Science, 2003, 299:13176.
［8］SADLON T J, LEWIS I D, D' ANDREA R J. BMP4: its role in development of the hematopoietic system and potential as a hematopoietic growth factor［J］. Stem Cells, 2004, 22(4):457-474.
［9］HOCK H, HAMBLEN M J, ROOKE H M, et al. Gfi?1 restricts proliferation and preserves functional integrity of haematopoietic stem cells［J］. Nature, 2004, 431(7011):1002-1007.
［10］STEPPAN C M, BAILEY S T, BHAT S, et al. The hormone resistin links obesity to diabetes［J］. Nature, 2001, 409:307-12.
［11］董天崴, 杨军, 王敬磊, 等. 细胞因子IL?7的研究进展［J］. 黑龙江医药, 2007, 10(30): 349-353.
