重组SARS?CoV S1蛋白抗原表位分析及抗原性检测

                     作者：邵红伟，蓝东明，陈尚武，刘泽寰，黄树林

【摘要】  目的 对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS?CoV）刺突蛋白（Spike, S）S1段进行原核重组表达，并检测表达产物的抗原性。方法 对S1中的HLA抗原表位进行预测分析，根据分析结果选定用于重组表达的区段，利用pET21b载体进行原核表达，将产物纯化后利用SARS抗血清进行抗原性检测。结果 抗原表位分析表明，S1中包含有多个能够被HLA分子有效提呈的抗原表位，综合考虑表位肽的分布、重组表达的效率、重组蛋白的空间构象以及引物设计的优化等因素，选取S1中的关键区域259～565 aa进行原核重组表达，得到了包涵体形式的重组蛋白，经过纯化和复性，获得了纯度较高的可溶性S1蛋白；用SARS抗血清对此重组蛋白进行免疫学鉴定，表明该蛋白具有SARS特异的抗原性。结论 重组表达的S1蛋白具有较强的抗原性，为进一步的疫苗研究和抗体筛选奠定了基础。

【关键词】  SARS；S1蛋白；抗原表位；重组表达
　　Abstract:Objective To express and confirm the antigenicity of the S1 fragment of spike protein of SARS?CoV.Methods The epitopes recognized by HLA in S1 were analyzed, and the proper fragment was selected to express with pET21b vector.The recombinant protein was subject to antigenicity assay after purification.Results Epitope analysis identified the nonamers, which could be presented by HLA molecule, in S1 protein.In view of the distribution of epitopes in S1 protein, the efficiency of recombinant expression, the conformation of recombinant protein, the optimization of primers design, and so on, a fragment (259～565aa) was selected to express in prokaryotic cell.The recombinant protein expressed as inclusion body was subject to purifying, denaturation, and renaturation, and purified soluble S1 protein was obtained.The special SARS?CoV antigenicity of this protein was identified by enzyme?linked immunosorbent assay (ELISA) with serum from convalescent SARS patients.Conclusion Recombinant S1 protein showed solid antigenicity.These results laid a foundation for the research of vaccine and neutralizing antibodies.

　　Key words:SARS, S1 protein, epitope, recombinant expression

　　严重急性呼吸系统综合征(severe acute respira?tory syndrome, SARS)，又称传染性非典型性肺炎（atypical pneumonia，简称“非典”），是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS coronavirus, SARS?CoV）引起的呼吸系统疾病。自从SARS大规模爆发之后，关于这种新型人类冠状病毒的各项研究，如病原学、流行病学、病毒基因组结构、病毒蛋白的重组表达、临床检测、疫苗的研制、公共卫生管等等，也随之快速开展了起来，并取得了很大的进展［1-3］。但作为一种新出现的病毒，人们对它的了解还远远不够，其致病机理迄今还没有被阐明［4］，有效的药物还没有发现，疫苗的研制尚处于初期阶段。因此利用现有资源进行治疗性疫苗和抗体的进一步研究非常有意义。　

    SARS?CoV的刺突蛋白（Spike, S）是病毒识别宿主细胞表面受体——血管紧缩素转化酶2（angiotensin?converting enzyme 2, ACE2）的关键分子，对于病毒的感染非常重要。许多研究表明，SARS康复病人的血清中普遍存在着抗Spike蛋白的抗体［5, 6］，同时SARS?CoV的Spike蛋白也能够有效地诱导中和抗体的产生［7］，因此Spike蛋白是进行疫苗和抗体研究的一个比较理想和有效的靶点。位于Spike蛋白N端的S1段（17～672aa）是同受体结合的关键部位，也是中和抗体作用的主要作用靶点［8］，考虑到整个Spike蛋白的分子量较大、结构复杂，进行重组表达较为不便，选择其关键的S1段进行操作是一种可行的方法。因此本研究基于前期相关研究结果，选取了Spike蛋白的S1段进行抗原表位分析，对其中259～565 aa的区段进行了原核重组表达，并对表达产物进行了纯化、复性和抗原性检测。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  质粒和菌株 

　　原核表达质粒pET21b购自Novagen公司；含有SARS?CoV Spike全长基因的载体pCAGGS/MCS?S由Luis Enjuanes教授惠赠。菌株E.coli BL21（DE3）［F ? ompT hsdSB(rB?mB?) gal dcm λ(DE3) (lacI lacUV5?T7 gene 1 ind1 Sam7 nin5)］和E.coli DH5α［supE44, lacU169 (Φ80 lacZ μ5), hsdR17, recA1, endA1, gyrA96, thi?1, relA1］均为本室保存。

　　1.1.2  酶类及其他试剂
 
　　Taq DNA polymerase购自上海Sangon生物公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自New England Biolabs；Tryptone和Yeast Extract为Oxoid公司产品；IPTG、考马斯亮蓝R?250、β?巯基乙醇、Tris碱等均为AMERSCO公司产品；酶标板购自Costar公司；SARS康复病人血清由中山大学第二附属惠赠；SARS冠状病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）购自北京华大吉比爱生物技术有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自Omega公司。

　　1.1.3  仪器设备
 
　　电泳仪、凝胶成像系统为美国Bio?Rad公司产品；PTC?200 PCR仪为美国MJ Research公司产品；桌面离心机、核酸蛋白定量仪为Eppendorf公司产品；JY92?Ⅱ型超声波细胞粉碎机购自宁波新芝科器研究所。

　　1.2  方法

　　1.2.1  S1蛋白的抗原表位分析     

　　为了确定进行重组表达的区段，本实验对S1蛋白进行了抗原表位分析。分析抗原表位的在线工具有很多，本研究采用了SYFPEITHI（http://www.syfpeithi.de/home.htm）预测分析工具。由于HLA?A0201是比较常见且研究较多的一个HLA分子，本实验确定其作为抗原提呈MHC，分析了S1中能够被其有效提呈的9肽表位。

　　1.2.2  S1基因的克隆 

　　基于抗原表位肽的分布情况，同时考虑到尽量保证要表达的蛋白质的空间构象的完整性、基因扩增的有效性、引物设计的优化原则等因素，本实验选择对S1蛋白的259～565 aa段进行重组表达。上游引物（775～794）： 5′?GCGGTACCATATGCCAACTACATTTATGCTCAA?3′；下游引物（1675～1695）：5′?CGCTCGAGAGGATC TCGAACGGAATCAGT?3′。以pCAGGS/MCS?S为模板进行扩增，将所扩S1片段插入原核表达载体pET21b后首先转化感受态DH5α，挑取阳性克隆进行测序分析，以确保所插入S1读码框正确无误。将序列正确的克隆进行接种、培养、提取质粒，转化表达宿主菌BL21，挑取阳性克隆备用。

　　1.2.3  S1蛋白在大肠杆菌中的表达 

　　挑取含有目的基因的单个BL21(DE3)菌落接种于LB培养基（Amp+）中，37 ℃，250 r/min，振荡培养过夜；以1∶100的比例放大培养，37℃，250  r/min，振荡培养至A600约为0.5～0.7；加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG进行诱导，于20 ℃继续培养4～6 h；6 000 g，4 ℃离心10 min，去上清后加入超声缓冲液（500 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 7.0）重悬（10 mL/g湿菌）沉淀；冰浴下超声4～5 个循环（200 W，超声4 s，间歇4 s，重复90 次为一个循环），6 000 g，4 ℃离心10 min，取上清及沉淀进行SDS?PAGE检测。

　　1.2.4  重组蛋白的变复性
   
　　将不溶的包涵体蛋白用20 mmol/L Tris?HCl (pH8.0)重悬，冰浴下超声1个循环；加入1%的Tritonx?100,再超声1个循环；6 000 g，4 ℃离心10 min，去上清，将沉淀用含有2 mol/L尿素的20 mmol/L Tris?HCl (pH 8.0)重悬，4 ℃搅拌30 min，并放置2 h；6 000g，4 ℃离心10 min，去上清，将沉淀溶于6 mol/L的盐酸胍溶液，放入透析袋中，系紧袋口；将透析袋放于大量不断搅动的透析缓冲液（pH8.0的20 mmol/L Tris?Hcl中含有0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽，0.9 mmol/L还原型谷胱甘肽，10%甘油，0.1% PEG8000及一定浓度的盐酸胍）中，于4 ℃进行透析复性；起始的透析缓冲液中含5 mol/L盐酸胍，其间通过更换透析缓冲液（6 h/次）的方式逐渐降低透析缓冲液中的变性剂的浓度（5 mol/L→3 mol/L→1 mol/L），最后于1×PBS中透析。

　　1.2.5  重组S1蛋白的免疫鉴定 

　　将经过变复性的S1蛋白溶于包被缓冲液（12.5  mmol/L碳酸钠，37.5 mmol/L碳酸氢钠）中，以10 μg/mL的浓度于4 ℃过夜包被空白酶标板，用SARS康复病人的阳性血清对此S1蛋白进行ELISA检测，用正常健康人的血清作为阴性对照血清，以购自北京华大吉比爱生物技术有限公司的包被有灭活病毒的酶标板作为阳性对照抗原，以BSA作为阴性对照抗原。

　　2  结果与分析

　　2.1  S1蛋白的抗原表位预测分析
   
　　对S1进行的在线抗原表位分析显示S1中含有多个能够同HLA?A0201分子结合的抗原表位肽（表1、图1），表明S1蛋白能够被细胞表面的HLA分子有效地提呈，表1和图1中均只选取了预测得分大于22的表位肽。之前有研究表明S1蛋白同受体结合的部位大致定位在约300～500 aa的区域［9,10］，考虑到有效表位肽的覆盖范围、所表达重组蛋白质空间构象的完整性、基因扩增的有效性以及引物设计的优化原则等等因素，本实验选择对S1蛋白的259～565 aa段进行重组表达（图1）。

　　2.2  S1基因的扩增
    　　
　　利用特异引物对Spike蛋白S1段基因进行PCR扩增，扩增产物通过1.5%（ρ）的琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示所扩基因片段的大小与理论值（921 bp）相符（图2）。将该片段进行胶回收后同T载体连接，然后转化E.coli DH5α，挑取阳性克隆进行测序分析，结果表明所扩S1基因的序列正确，可以用来进行原核的重组表达。

　　2.3  重组S1蛋白的原核表达
         　　
　　将S1基因亚克隆入原核表达载体pET21b，构建成重组表达载体pET21b?S1。将构建好的pET21b?S1转化E.coli BL21，鉴定后挑取阳性克隆接种培养，培养物生长至A600值约为0.6左右时，加入IPTG进行诱导。20 ℃诱导培养约5 h后离心收获培养物，培养物经洗涤后重悬在超声缓冲液中进行超声破碎，裂解物经离心后，分组份进行SDS?PAGE分析（图3）。电泳结果显示总菌和包涵体中含有大量的S1蛋白，超声上清中没有发现目的条带，表明S1蛋白在原核细胞中主要以包涵体的形式存在。表1  S1蛋白中HLA?A0201抗原表位（9肽）预测结果（略０

　　2.4  重组S1蛋白的纯化
        
　　对S1包涵体蛋白进行梯度洗涤：先用20 mmol/L Tris?HCl (pH8.0)缓冲液进行超声洗涤，再用含有1% Tritonx?100的20 mmol/L Tris?HCl (pH8.0)缓冲液进行超声洗涤，最后用含有2 mol/L尿素的20 mmol/L Tris?HCl (pH8.0) 缓冲液洗涤。将经过洗涤的S1沉淀溶于6 mol/L的盐酸胍溶液，装入透析袋中，放入不断搅动的透析缓冲液中于4 ℃进行梯度透析复性。透析结束后将S1蛋白进行SDS?PAGE分析。图4显示，经过纯化后绝大部分的杂蛋白都已经被去除，为下一步对S1蛋白的免疫鉴定实验奠定了基础。

　　2.5  重组S1蛋白的抗原性检测
        
　　将经过复性的S1蛋白以10 μg/mL的浓度于4 ℃过夜包被酶标板，然后通过ELISA的方法，利用来源于SARS康复病人的阳性血清对包被于酶标板上的S1蛋白进行免疫鉴定，以确定所表达的S1蛋白能否被SARS抗血清所识别。结果显示（图5），S1蛋白同阳性对照（灭活病毒）一样能够被SARS抗血清所特异性地识别，而正常人的阴性血清则没有显示出反应信号，表明重组表达的S1蛋白具有很强的抗原性。以BSA做为阴性对照抗原，SARS阳性和阴性血清都没有反应信号出现。

　　3  讨 论
       
　　S蛋白是SARS?CoV颗粒的主要外壳成分之一, 也是病毒同宿主细胞表面受体结合以及病毒诱发机体产生抗体或细胞免疫反应的重要因子。S蛋白可分为S1段和S2段，S1片段参与病毒与宿主细胞间的识别，S2片段参与病毒包膜与细胞膜融合的过程［11, 12］。SARS?CoV的S1段是指S蛋白中从17～672 aa的一段区域，对这段蛋白进行的抗原肽预测表明，其中存在着很多能够同HLA分子结合的抗原表位（图1、表1），特别是从～250 aa到～500 aa的区域中存在着能够同HLA分子以较高亲和力结合的抗原表位，暗示这一区域对于刺激机体免疫应答具有重要的作用。此外，之前的一些研究表明这段区域中包含着S蛋白同受体ACE2结合的部位，Hu等人报道S1中同ACE2结合的部位在471～503 aa的区域内［9］，He［10］等人的研究也表明S蛋白中318～510 aa段含有能够诱导中和S?ACE2反应的多个空间表位和线性表位。因此针对这段区域设计疫苗具有非常重要的意义。
        
　　综合考虑表位肽的分布、重组表达的效率、蛋白结构的空间构象、以及引物设计的优化等因素，本文对S1蛋白259～565 aa段进行了原核重组表达，对得到的包涵体形式的蛋白进行纯化和复性，获得了纯度较高的重组蛋白。之后对这段S1蛋白进行的抗原性检测结果显示，重组S1蛋白能够被SARS康复病人血清中的抗体所特异性地识别，并且反应活性很强，表明重组表达的S1蛋白具有较好的抗原性，可进一步用于免疫动物以制备抗血清或者单克隆抗体。
        
　　综上所述，S1蛋白259～565 aa段是诱导机体免疫反应的重要区域，同时还是病毒识别受体的关键区域，针对这一区域设计重组疫苗或者制备性抗体对于预防和治疗SARS病毒的感染具有重要的意义。

【】
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