绵茵陈药材高效液相色谱指纹图谱研究
作者：王凤云，江滨，曾元儿， 张军
【摘要】 目的 建立绵茵陈药材的HPLC指纹图谱，为其质量控制提供依据。方法 采用反相高效液相色谱法，并进行相应的方法学考察，对不同产地和批次绵茵陈药材进行质量评价。结果 采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相以乙腈和体积分数为0.2％的磷酸水溶液进行梯度洗脱，柱温35 ℃，流速1.0 mL· min-1，检测波长327 nm；该方法稳定性、精密度、重复性良好,可用于绵茵陈药材的指纹图谱测定；不同批次的绵茵陈药材在图谱上存在一定的差异。结论 该结果可为绵茵陈药材的质量控制提供依据。
【关键词】 绵茵陈；高效液相色谱法；指纹图谱
Abstract:Objective To establish HPLC fingerprints of Herba Artemisiae scopariae and offer some information for the quality control of Herba Artemisiae scopariae.Methods and Results The fingerprints of Herba artemisiae scopariae from different habitats and batches were established by reversed-phase high performance liquid chromatography. The sample was analyzed on a Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm） column under gradient elution. The mobile phase consisted of acetonitrile and H2O(0.2% H3PO4) and the flow rate was 1.0 mL · min-1. The detection wavelength was 327 nm. The stability, accuracy and credibility of this method were good.Conclusion This method offers some information for the quality control of Herba Artemisiae scopariae.
Key words: Herba Artemisiae scopariae; HPLC; HPLC; fingerprints
茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaries Thunb的干燥地上部分。其中春季采收的习称“绵茵陈”，具有清湿热、退黄疸的功效［1］。报道，不同产地和采收期的茵陈药材质量差异较大［2-3］。本实验采用反相高效液相色谱法对绵茵陈药材建立指纹图谱，并进行相应的方法学考察，初步考察市售不同批次绵茵陈药材的质量差异，为绵茵陈药材的质量控制提供依据。
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（DIONEX）配P680高压泵；ASI?100自动进样器；UVD170U检测器；STH585型柱温箱；Chromeleon程序控制系统。绿原酸对照品（药品生物制品检定所提供，0736-200117），甲醇、乙腈（色谱纯，MERCK公司）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 品种鉴定
指纹图谱所用的不同批次绵茵陈药材均购于广州市药材公司、广州清平药材市场、广州致信药业有限公司，其产地分别为江西（市售1）、山西（市售2）、山东（市售3）、安徽（市售4）、河南（市售5）、山西（市售6）、陕西（市售7）、山东（市售8）、宁夏（市售9）、安徽（市售10）。根据《中国药典》2005版一部茵陈［性状］项下的规定，与《中华人民共和国药典中药彩色图谱集》、《新编中药志》中照片与描述，经广东药学院中药鉴定教研室刘基柱老师鉴定为菊科植物滨蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit或茵陈蒿Artemisia capillaries Thunb春季采收的干燥幼苗。
2.2 供试品溶液的制备
取本品粉末约0.5 g，精密称定，加入体积分数为80％的乙醇100 mL，置水浴上加热回流1 h，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用体积分数为80％的乙醇溶解，置25 mL棕色量瓶中，加体积分数为80％的乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3 对照品溶液的制备
取绿原酸对照品适量，精密称定,置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。
2.4 色谱条件
Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相采用二元体系，流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.2％的磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0 min（5％A）,10 min（10%A），45 min（25％A）；柱温35 ℃，流速1.0 mL· min-1，检测波长327 nm。
2.5 指纹图谱试验的方法学验证
2.5.1 绿原酸标准曲线的制备 取绿原酸对照品溶液（40.8 μg/mL），分别进样2、4、6、8、10、16、20 μL，按照上述色谱条件进行测定，以绿原酸质量为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程为：Y=2 553.1X+2.884 7,（r=0.999 9），表明绿原酸在0.081 6～0.816 μg范围内线性关系良好。
2.5.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0、1、2、4、8和12 h进行检测，直观指纹图谱全貌无明显变化，经中药色谱指纹图谱相似度评价软件（国家药典委员会2004A，以下同），与对照图谱比较，相似度均大于0.9，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.41％、1.22％，表明在12 h内供试品溶液具有良好的稳定性。
2.5.3 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6次，进行检测，直观指纹图谱全貌无明显变化，经相似度评价，相似度均大于0.9，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为0.42％、0.31％，表明该方法精密度良好。
2.5.4 重复性试验 取同一种药材样品6份，按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测，直观指纹图谱全貌无明显变化，经相似度评价，相似度均大于0.9，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD分别为1.13％、1.20％，表明该方法重复性良好。
2.6 HPLC指纹图谱建立与相似度评价
取不同批次市售绵茵陈药材共10批，按照供试品溶液的制备和检测方法进行检测，对数据进行分析，以10批药材的均值生成对照图谱，经相似度评价软件计算不同药材与对照图谱之间的相似度。结果表明各批药材相似度均在0.9以上，证明相似度良好（见图1）。比较获得的色谱图，共确定15个共有峰，其中4号峰为绿原酸峰，将其作为参照物峰，理论板数均不低于6 000（见表1）。（略）
3 讨论
3.1 绵茵陈药材的化学成分主要包括香豆素类、色原酮类、黄酮类、香豆酸及其他有机酸类等［3］，其中以绿原酸为主的有机酸类及香豆素类成分为主要有效成分，因此选择这些成分为本品色谱指纹图谱的分析对象。
3.2 检测波长的选择 鉴于绵茵陈中的主要有效成分为绿原酸及香豆素类，均在327 nm左右有最大吸收，且其他一些黄酮类成分在该波长下也有一定的吸收，同时对不同波长(203、254、320、327 nm)的HPLC图谱进行比较，结果证明在327 nm波长下基线平，峰形较好，各峰峰面积值最大，因此确定检测波长为327 nm。
3.3 柱温的选择 考察了15、25、35 ℃柱温对色谱分离效果的影响，结果表明，15 ℃时出峰较晚，基线不平，25 ℃和35 ℃时分离效果无明显区别， 35 ℃时分离效果佳，同时保留时间较短，因此最终确定柱温为35 ℃。
3.4 实验中还考察了不同厂家和型号的色谱柱以及不同的HPLC色谱仪器对绵茵陈药材指纹图谱的影响，结果各种色谱柱在不同的仪器上所测得的图谱没有明显差异。表明该实验所建立的方法具有较好的系统适应性和稳定性。
3.5 实验中共对13批不同绵茵陈药材进行了考察，相似度计算结果发现有3批（市售5、市售8和市售13）相似度小于0.9。市售5绵茵陈各成分含量非常低且出峰个数较少；市售8和市售13绵茵陈在各峰比例上与对照图谱存在较大区别，而且绿原酸含量较低（分别为0.10％和0.03％）。结果提示不同批次的绵茵陈药材在质量上存在较大的差异。
【】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2005年版一部［S］.北京：化学出版社，2005：166.
［2］ 曾美怡,张启伟,姚三桃,等.绵茵陈的化学成分和质量评价研究［J］.国外医学:中医中药分册,1987,9(6):321-328.
［3］ 张启伟,章育中.滨蒿中利胆成分的含量测定［J］.药学学报,1986,21(12):922.
