原花青素对CIA大鼠足爪组织中NF?κB/p65蛋白和血清中某些促炎性细胞因子表达的影响

                 作者：林观平，刘国玲，丁伟斌，梁统，周克元 

【摘要】  目的 研究原花青素对Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎（CIA）大鼠足爪组织中核转录因子NF?κB/p65蛋白表达的抑制作用和血清中炎性细胞因子IL?1β、TNF?α等水平的影响。方法 建立Ⅱ型胶原诱导的CIA大鼠模型，免疫组化法检测足爪组织中NF?κB/p65蛋白的表达，ELISA法检测CIA大鼠血清中IL?1β和TNF?α的含量。结果 原花青素能剂量依赖性地下调NF?κB/p65蛋白的表达，降低CIA大鼠血清中TNF?α和IL?1β的水平。结论 原花青素对CIA大鼠炎症的抑制作用可能与其下调NF?κB/p65蛋白表达、降低促炎性细胞因子TNF?α、IL?1β的水平有关。

【关键词】  原花青素；Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎；NF?κB/p65；TNF?α；IL?1β

　　Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of proanthocyanidins on the expression of NF?κB/p65 protein in the tissue of Type Ⅱ collagen?induced arthritis (CIA) rat′s paws, and the effects of proanthocyanidins on the contents of TNF?α、IL?1β in CIA rat′s serums.Methods CIA model in SD rats was established. The proteins expression of NF?κB/p65 and MMP?9 in the skin of the rats paws was analyzed with immunohistochemistry. The contents of TNF?αand IL?1β in CIA rats serum were measured with ELISA.Results  Proanthocyanidins can down?regulate the expression of NF?κB/ p65 protein and decrease level of TNF?αand IL?1β in CIA rats serums.Conclusion  The anti?inflammatory mechanisms of proanthocyanidins may be related to decreasing the protein expression of NF ?κB/p65 and suppressing proinflammatory factors, i.e., TNF?α and IL?1β  in CIA rats.

　　Key words:proanthocyanidins； type Ⅱcollagen?induced arthritis (CIA)； NF?κB/p65 ；TNF?α； IL?1β

　　类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现［1］。其发病机理尚不完全明确，传统RA的药物虽能起到抑制RA的作用，但副作用大，因此寻找安全有效的治疗RA的药物是目前RA研究的重点。原花青素是一大类多酚类化合物的总称，由不同数量的儿茶素或表儿茶素组成，具有抗过敏、抗肿瘤、改善心血管、抗炎等多方面的作用［2］。为进一步探讨原花青素的抗炎作用机制，本实验以CIA大鼠为炎症模型，研究原花青素对CIA大鼠NF?κB/p65蛋白表达及血清中促炎性细胞因子TNF?α、IL?1β含量的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料
        
　　原花青素(proanthocyanidins)（南京学子医化研发中心，纯度95%），弗氏完全佐剂、Ⅱ型胶原、多聚赖氨酸（Sigma公司），地塞米松(Dexamethasone)盐酸注射液（5 mg/mL，河南确山龙渊药业有限公司），氯化钠注射液（石家庄四药股份有限公司），冰醋酸（分析纯，广州化学试剂二厂），TNF?αELISA试剂盒、IL?1β ELISA试剂盒、80?2型离心机（上海手术器械厂），450型酶标免疫测定仪（美国Bio?Rad公司），Leica RM 2135型石蜡切片机（德国Leica公司），Galanz微波炉（广东格兰仕集团公司），NF?κB/p65羊IgG单克隆抗体免疫组化S?P试剂盒（北京中山公司）。超清级SD大鼠，雌雄各半，体质量180 g左右，由广东医学院动物中心提供，合格证号：2006A027。

　　1.2  方法

　　1.2.1  Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎（CIA）模型的制作  实验用大鼠60只，雌雄各半，按统计学方法随机分为6组:A 正常组对照组，B 模型对照组，C地塞米松组（2 mg/kg），D原花青素大剂量组(30 mg/kg)，E 原花青素中剂量组(6 mg/kg)，F 原花青素小剂量组(1.2 mg/kg)，每组10只。将Ⅱ型胶原15 mg溶于7.5 mL 预先配制好的0.1 mol/L 的醋酸中，质量浓度为2 mg/mL,共7.5 mL，4 ℃过夜，充分溶解。次日，与弗氏完全佐剂等体积于冰浴中混合，使之充分乳化，制成稳定的乳化剂15 mL,每毫升含1.0 gⅡ型胶原,置4 ℃冰箱保存备用。SD大鼠，除正常对照组外，以0.1 mL /只的剂量在鼠的左后肢足跖皮内注射。操作时，先将注射部位以75%(ρ)酒精棉球消毒，然后用1 mL注射器注射乳化剂，见皮肤鼓起一小丘后拔针，诱导大鼠发生类风湿性关节炎(CIA)。正常对照组在同一部位同法注射0.1 mL生理盐水。实验在广东医学院动物中心实验室进行。于造模后第7天腹腔注射（原花青素）给药，每天1次，一直给药至第27天。按照大鼠体质量给药1.0 mL/100 g，正常对照组和模型组注射生理盐水。

　　1.2.2  免疫组化法测大鼠足爪组织中NF?κB/p65蛋白的表达  ①取下足跖部位的组织，用10%(φ)中性缓冲甲醛溶液及时固定，石蜡包埋，切片，贴片（载玻片预先用多聚赖氨酸浸泡，捞片后60 ℃加热60 min，以使切片紧密黏附），常规脱蜡脱水。②0.1 moL/L PBS(pH7.4)浸泡5 min。③微波修复抗原：将切片浸入0.01 moL/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，以微波炉加热至100 ℃，持续5 min后，反复2次。室温冷却后，用0.1 moL/L PBS洗涤5 min×2次。④滴加封闭液（试剂B），室温20 min。甩去多余液体，不冲洗。⑤滴加1∶50稀释的NF?κB/p65羊IgG单克隆抗体(或MMP?3小鼠IgG单克隆抗体)，阴性对照以PBS代替一抗，于4 ℃孵育过夜。0.1 moL/L PBS洗涤5 min×3次。⑥滴加链霉菌抗生物素?过氧化物酶溶液（试剂C），室温孵育10 min，0.1 moL/L PBS洗涤5 min×3次。⑦滴加试剂SABC（试剂D），37 ℃，30 min，PBS冲洗5 min×3次。⑧DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1 mL蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，自来水冲洗。⑨苏木素轻度复染，脱水，透明，中性胶封片。显微镜观察。
        
　　结果判断：以胞浆出现淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，光学显微镜下观察，每组随机计数500个细胞，阳性表达率。同时观察染色强度，按染色强度着色淡黄为弱阳性（+），棕黄为阳性（++），棕褐为强阳性（+++），无着色为阴性（—）。

　　1.2.3  CIA大鼠血清中TNF?α和IL?1β含量的测定  对CIA模型鼠注射原花青素或生理盐水, 每天1次, 每次按大鼠体质量给药1.0 mL/100 g，实验第27天，向CIA大鼠腹腔内注射3%巴比妥那0.3～0.4 mL使麻醉。剪开大鼠腹腔，以10 mL注射器心脏取血，室温静置1 h，3  000 r/min离心15 min，吸取上层血清。用ELISA法(按试剂盒说明书操作)测定CIA大鼠血清中TNF?α和IL?1β的含量。

　　1.2.4  统计学处理  数据表示为±s，采用SPSS 11.0软件进行分析，行单因素方差分析和显著性检验，方差齐时，各组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时，则采用Tamhance′s T2检验,P<0.05表示差异有显著性，P<0.01表示差异有非常显著性。