RP?HPLC法测定小鼠血浆中蒿甲醚的浓度
【摘要】 目的 建立测定小鼠血浆中蒿甲醚浓度的方法。方法 采用RP?HPLC法，色谱柱为Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm），流动相为甲醇?水（体积比85∶15）；流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为室温。利用甲基叔丁基醚对小鼠血浆及组织中蒿甲醚及蒿乙醚进行提取后进行测定。结果 蒿甲醚与蒿乙醚的色谱峰分离良好并且出峰时间相近，以蒿乙醚为内标测定血浆中蒿甲醚符合方法学要求，血浆标准曲线在一定范围内线性关系良好（R2=0.9991,n=5）,高、中、低3个浓度的回收率均为97%以上，日内及日间RSD均小于3%。结论 建立的方法可简单快速测定蒿甲醚在小鼠血浆中的浓度，为内标法测定蒿甲醚在动物血浆中的浓度提供思路。
【关键词】 蒿甲醚；蒿乙醚；高效液相色谱法；内标法；血药浓度
Content analysis of artemether in mice plasma by RP?HPLC
WANG Hao, LI Li?juan, DENG Ying?jie
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)
Abstract:Objective To establish a method for determining the contents of artemether and arteether in mice plasma by RP?HPLC.Methods Artemether and arteehter in mice plasma were extracted by methyl tert?butyl ether before detection, then analyzed on a Diamonsil C18 column（150 mm×4.6 mm, 5 μm）. The mobile phase consisted of methanol?water（85∶15）. The flow rate was 1.0 mL/min. The wavelength was 210 nm and room temperature was selected for determination of artemether.Results The chromatographic peaks of artemether and arteether were totally separated with similar retention times at the selected HPLC condition. There was a good linearity for artemether analysis when arteether was used as the inner standard (r=0.9991,n=6). The recoveries were all more than 96% during high, middle and low concentration of artemether. RSDs of within?days and between?days were all less than 3%.Conclusion The concentration of artemether in plasma could be analyzed easily and rapidly by the established HPLC method.
Key words:artemether; arteether; HPLC; inner standard method; blood drug level
青蒿素（qinghaosu,QHS）类化合物是我国在90年代初期开发的具有良好抗疟疾活性的倍半萜类化合物［1］。其中，青蒿素的脂溶性衍生物蒿甲醚(artemether,ARM)近年来颇为引人关注，其抗疟疾效果是青蒿素的10倍［2］。最近，青蒿素类化合物在抗癌领域也受到越来越广泛的关注，尤其是在抗非小细胞肺癌及白血病方面有显著作用［3-4］。
蒿甲醚的含量测定方法报道的有紫外分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法，但这些方法仅限于蒿甲醚制剂含量的测定、体外释放测定［5-6］或用于生物样品含量测定［7-8］。采用内标法并用高效液相色谱-紫外法测定其在血浆中的含量的方法尚未见文献报道。蒿乙醚(arteether,ARE)曾被用作抗血吸虫药物［9］，与蒿甲醚结构相似，同为α?构型双氢青蒿素的甲基化、乙基化衍生物，化合物的结构见图1。本文以蒿乙醚为内标物质，采用RP?HPLC法测定小鼠血浆中蒿甲醚的浓度。
图1 青蒿素（A）、蒿甲醚（B）、蒿乙醚（C）化学结构图（略）
Fig.1 Structures of arteannuin(A),artemether(B) and arteether (C)
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱仪（LC?10ATVP泵，SPD?10AVP紫外检测器，日本岛津公司），TGL?16 G高速微型台式离心机（上海医分仪器制造有限公司），80?2离心机（金坛市荣华仪器制造有限公司），XW?80A涡旋振荡器（上海精科实业有限公司）。
1.2 材料
蒿甲醚（上海DESANO公司惠赠，质量分数＞97%），蒿乙醚（质量分数为99%，以青蒿素为原料经本实验室合成，青蒿素由上海DESANO公司惠赠），甲醇（色谱纯，江苏汉邦有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团）,甲基叔丁基醚（tert?butyl methyl ether,TBME,国药试剂集团）。
1.3 实验动物
昆明种小白鼠：沈阳药科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽)2003-008。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm,迪马科技有限公司）；流动相：甲醇?水（体积比85∶15）；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：室温30 ℃;进样量：20 μL。
2.2 血浆样品的处理
取昆明种小鼠数只，摘眼球后取血于涂有肝素的小试管内，取离心后的上层血浆250 μL于10 mL具塞试管内，分别加入6.32 mg/mL的蒿甲醚甲醇溶液20 μL,63.2 mg/mL的蒿甲醚甲醇溶液5 μL,15 μL。涡旋3 min，再加入5 mL甲基叔丁基醚涡旋3 min,3 500 r/min下离心3 min后取上清液3 mL，氮气吹干，用甲醇150 μL溶解，进样20 μL，记录峰面积。
2.3 方法专属性
从图2可见，蒿甲醚与蒿乙醚的出峰时间分别为6.5 min和8.28 min,两种物质的出峰时间相近，并且都能在10 min之前出峰，分离度良好（R=6.14）。
2.4 血浆中蒿甲醚含量测定标准曲线的制备
取3份250 μL小鼠血浆，分别加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液10、20、30、40 μL和63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 μL，15.82 mg/mL的内标蒿乙醚20 μL，以蒿甲醚与蒿乙醚峰面积的比值为横坐标，蒿甲醚在小鼠血浆中的浓度为纵坐标作图得内标法的线性关系曲线，y=243.44x+4.152，R2=0.999 1，线性范围0～3.792 mg/mL。
A.甲醇溶液中蒿甲醚(ARM)与蒿乙醚(ARE)的色谱图
B.提取后的空白血浆色谱图
C.提取后的空白血浆中添加蒿甲醚与蒿乙醚后的色谱图
D.甲醇溶液中青蒿素(QHS)与蒿甲醚的色谱图
图2 高效液相色谱图（略）
Fig.2 HPLC chromatograms
2.5 提取回收率
按“2.1.2”项下处理血浆样品后，高、中、低3个浓度的蒿甲醚在小鼠血浆中的提取回收率(n=3)分别为(84.8±1.6)%，(83.5±1.1)%，(73.0±2.9)%。
2.6 方法回收率
分别量取250 μL小鼠血浆，精密加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 μL,35 μL，63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液7 μL, 按“2.1.2”项下处理后测定色谱峰面积，代入标准曲线换算成实际测定浓度，低、中、高3个浓度的回收率（n=3）分别为(98.7±1.3)%(98.2±1.7)%,(96.8±2.1)%。
2.7 精密度试验
分别量取250 μL小鼠血浆，精密加入6.32 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液15 μL,35 μL，63.2 mg/mL蒿甲醚甲醇溶液7 μL，按“2.1.2”项下处理，于1 d内和连续3 d重复进样3次,测得日内RSD分别为1.736%，1.979%，1.085%，日间RSD分别为1.912%，2.031%，1.257%。
3 讨论
3.1 本研究采用蒿甲醚的同系物蒿乙醚为内标物，建立了RP?HPLC法测定小鼠血浆中蒿甲醚的含量。实验中最初选择青蒿素作为内标，但该化合物在设定的色谱条件下出峰过早，在3.2 min左右(见图2)，从色谱图上可见在该位置有较大的杂质峰，容易对内标峰造成影响。
3.2 蒿甲醚的化学结构中无发色环系，仅有一个过氧桥键，本文参照［9］的色谱条件采用属于末端吸收范围的210 nm作为检测波长，在此波长下，蒿乙醚同样可产生足够的紫外吸收。本文参照文献［9］设定了色谱条件，蒿甲醚的出峰时间在7 min左右，理论塔板数为2 881，加入的内标物蒿乙醚出峰时间在9 min左右，理论塔板数为4 712，二者出峰时间相近且分离完好，分离度为6.14。实验结果证明方法专属性强，达到了预期的目的。
3.3 以待测物质蒿甲醚与内标物蒿乙醚峰面积比值为横坐标，以蒿甲醚在小鼠血浆中的质量浓度为纵坐标，所得标准曲线线性关系良好，线性范围宽，方法回收率、精密度等均符合方法学要求。表明可采用蒿乙醚为内标对血浆中的蒿甲醚进行含量测定，进而对蒿甲醚制剂的药动学进行研究，该方法对动物其他组织中蒿甲醚含量测定亦有参考价值。
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