钌(Ⅱ)配合物合成及其与DNA键合方式研究

                 作者：黄晓媚，刘云军，何丽新，赵豪杰，梅文杰'

【摘要】  目的与方法 合成一个新的配体HPIA及其钌（Ⅱ）多吡啶配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4 (bpy=2,2′?联吡啶，HPIA=2?（2?羟基苯基）咪唑并［4, 5?f］苊），用元素分析、电喷雾质谱、快原子轰击质谱、核磁共振谱表征配体及配合物；用吸收光谱和黏度测试研究配合物与DNA的作用方式。结果与结论 配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4与DNA之间通过插入作用结合。

【关键词】  钌（Ⅱ）配合物；DNA；黏度测试;键合方式

　　Abstract:A new ligand HPIA (2?(2?hydroxyphenyl)?imidazo［4,5?f］ acenaphylene, bpy=2,2′?bipyridine) and its ruthenium(II) complex ［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4 have been synthesized and characterized by elemental analysis, mass spectra and 1HNMR. The electrochemical behaviors of the complex were investigated by cyclic voltammetry. The DNA?binding properties of the complex were studied by spectroscopic methods and viscosity measurement. The experimental results indicate that the complex ［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4 interacts with calf thymus DNA (CT?DNA) by intercalative mode into the base pairs of DNA.

　　Key words:［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4;DNA; viscosity measurement

　　核酸是生物体的重要组成物质，它包含遗传信息，并参与这些信息在细胞内的表达，从而促成代谢过程并控制这一过程。近年来，研究小分子过渡金属化合物与DNA的相互作用成为生物无机化学领域十分活跃的课题［1］, 其研究目的在于寻找DNA二级结构探针和DNA光断裂试剂。随着对金属配合物与DNA作用的深入研究，现在普遍认为小分子化合物与DNA的非共价结合有静电作用、面式结合和插入结合3种作用机理，许多重要的应用要求配合物以插入方式与DNA结合。由于钌(Ⅱ)多吡啶配合物具有丰富的光化学、光物理、电化学性质，因此可以利用光谱的变化来判断配合物与DNA的结合模式。本文合成了一个新的配体及其配合物，合成路线见图1，采用核磁共振、质谱和元素分析对其进行表征，电子吸收谱变化结果表明配合物与DNA之间存在较强亲和力，黏度测试表明配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4与DNA之间通过插入方式与其结合。

　　1  实验部分

　　1.1  试剂与仪器
    　　
　　实验中使用的试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化，缓冲溶液用双蒸水制备；DNA购自华美公司，用Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液配成一定浓度的储备液于冰箱中保存；配合物用5 mmol/L Tris?HCl，50 mmol/L NaCl(pH=7.0)缓冲溶液配制。
       
　　LCQ电喷雾质谱仪(ESMS, Finnigan)，快原子轰击质谱（FAB?MS)使用VG ZAB?HS质谱仪，Elemental Vario EL 元素分析仪，Bruker ARX?500型核磁共振仪，Shimadu?UVPC?3000 型紫外-可见光谱仪，黏度测试使用乌氏黏度计。

　　1.2  配体2?（2?羟基苯基）咪唑并［4,5?f］苊(HPIA)的制备
   
　　苊醌 (0.455 g, 2.5 mmoL)，0.4 mL水杨醛，NH4Ac(3.88 g, 50 mmoL)和冰醋酸(20 mL)置250 mL三颈瓶中，在130 ℃回流2 h，冷却反应液，用体积分数为25%的氨水中和，出现黄色沉淀，滤过，用水洗涤，真空干燥，乙醇重结晶，得黄色粉末0.539 g，产率 76%。元素分析值（%)： C 80.27， H 4.25， N 9.85；实测值（%）：C 80.24， H 4.28， N 9.83；FAB?MS：m/z=285 ［M+1］。

　　1.3  配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4合成
       
　　往［Ru(bpy)2Cl2］·2H2O［2］ (0.3 g, 0.57 mmoL), AgClO4 (0.24 g, 1.17 mmoL)混合物中，加入乙醇(20 mL)，加热回流1 h，冷却，用沙星漏斗过滤（三颈烧瓶接收滤液），往滤液中加入配体HPIA (0.173 g, 0.57 mmoL)，在氩气保护下，加热回流12 h，反应后，冷却至室温, 过滤，加入饱和NaClO4 溶液，得棕红色沉淀，抽滤，用冷乙醇洗涤，真空干燥，用乙腈?甲苯（V ∶V=3 ∶ 1）重结晶，产率 64%（0.290 g)。元素分析计算值（%)： C，58.83，H，3.42，N，10.56；实测值（%）：C，58.81，H，3.45，N，10.55。ES?MS (CH3CN)：696.3 ［M?ClO4］+。1HNMR (DMSO?d6 )δ：8.80 (d, 2H,J=8.5 Hz), 8.74 (d, 2H,J=8.4 Hz), 8.70 (d, 2H,J=8.6 Hz), 8.67 (d, 2H,J=8.2 Hz), 7.98-8.02 (m, 4H), 7.95 (d, 2H, J=8.0 Hz), 7.91 (m, 2H), 7.66-7.77 (m, 2H), 7.64 (d, 1H, J=8.2 Hz), 7.51 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.45-7.49 (m, 4H), 7.30-7.34 (m, 1H), 7.06 (t, 1H, J=7.6 Hz)。

　　1.4  实验方法
    　　
　　电子吸收光谱实验中，在参比池和样品池中加入等量的DNA以消除DNA本身的吸收，第一次加入DNA与配合物的浓度之比为0.7，直到比值等于7时，配合物的电子吸收光谱不再变化，此时电子吸收光谱滴定达到饱和。
    　　
　　测量黏度时，温度固定在(28 ± 0.1)℃。测试液配制方法：固定DNA的浓度，逐渐增加配合物的浓度。 相对黏度按下式计算：

　　η=(t–t0)/t0
   
　　式中，t0为缓冲溶液流经毛细管所需时间，t为DNA溶液（含不同浓度的配合物）流经毛细管所需时间. 以 (η/η0)1/3对结合比率r(r=［Ru］/［DNA］)作图。 η0为未加配合物的溶液的相对黏度。

　　图1  配体及配合物合成路线（略）

　　Fig.1  Synthetic routes of the ligand and complex

　　2  结果与讨论

　　2.1  配合物的电化学性质
   
　　配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］ClO4的电化学性质测试在乙腈溶液中进行。在扫描范围（-2.0～+2.0 V）出现金属到配体的氧化和配体的一系列还原，氧化峰对应于Ru(Ⅱ) 配合物失去一个变成Ru(Ⅲ)，其氧化电势为1.30 V，类似母体配合物［Ru(bpy)3］2+ (1.29 V)，根据［3］，第一个还原峰(-1.45 V)和第二个还原峰值(-1.65 V)，归属于辅助配体bpy的还原。

　　2.2  电子吸收光谱滴定实验
    　　
　　配合物的插入配体插入到DNA碱基对之间，与碱基对发生π电子堆积后，其π*空轨道与碱基的π电子轨道发生耦合，能级下降，从而导致π?π* 跃迁能减小，产生红移；同时，耦合后的π轨道因部分填充电子，使π?π* 跃迁几率减小，产生减色效应；配合物与DNA作用前后的吸收光谱如图2所示。图2表明随着小牛胸腺DNA (CT?DNA)加入，配合物的电子吸收光谱发生减色和一定程度红移，在紫外区(292 nm)减色率达20.5%，而MLCT峰(485 nm)处，减色率为11.6%，红移2 nm，说明配合物与DNA之间存在较强的作用力。

　　图2  Tris?HCl缓冲溶液中，配合物随小牛胸腺DNA的加入，电子吸收光谱的变化, ［Ru］=20 μmol/L. 箭头表示随DNA浓度的增加，配合物吸收光谱的变化（略）

　　Fig.2  Absorption spectra of complex ［Ru(bpy)2(PIA)］2+ in Tris?HCl buffer upon addition of CT?DNA, ［Ru］=20 μmol/L.Arrow shows the absorbance changing upon the increase of DNA concentration

　　2.3  黏度测试
    　　
　　黏度测试是判断配合物与DNA作用方式的最有效的方法之一。当小分子配合物以插入配体通过经典插入方式与DNA作用时，DNA相邻碱基对的距离会增大以容纳插入配体，导致DNA双螺旋伸长，于是DNA溶液的黏度就增加［4,5］；当以静电、沟面结合等非插入方式与DNA作用时，DNA溶液的黏度变化不大或基本不变；以部分或非经典插入方式与DNA作用时，则可能使DNA双螺旋发生扭结或弯曲，使其黏度减少。
    　　
　　图3是溴化乙啶(EB)和配合物 ［Ru(bpy)2(HPIA)］+与DNA作用黏度变化图。 EB是典型的DNA插入试剂，与DNA溶液作用时黏度明显升高，［Ru(bpy)2(HPIA)］+与DNA作用情况类似EB，所以配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］+与DNA也是以插入方式结合的。

　　EB(▲), ［Ru(bpy)2(HPIA)］+ (●)，温度为(28±0.1)℃, ［DNA］=0.5 mmol/L

　　图3  随着配合物浓度的增加，DNA溶液黏度变化图（略）

　　Fig.3  Effect of increasing amounts of EB (▲) and complex ［Ru(bpy)2(HPIA)］+ (●) on the relative viscosity of CT?DNA at (28 ±0.1)℃, ［DNA］=0.5 mmol/L.

　　3  结论
   
　　本文合成了一个新的配体HPIA及其配合物［Ru(bpy)2(HPIA)］+，用元素分析、质谱和核磁共振对其进行表征。通过电子吸收光谱和黏度测试研究配合物与DNA作用，研究结果表明配合物通过插入配体HPIA插入到DNA的碱基对中。

【文献】
  　　［1］ SIGMAN D S, MAZUMDER A, PERRIN D M.Chemical nuleases［J］.Chem Rev, 1993, 199：2295.

　　［2］ SULLIVAN B P, SALMON D J, MEYER T J. Mixed phosphine 2,2’?bipyridine complexes of ruthenium(Ⅱ)［J］.Inorg Chem, 1978,17:3334.

　　［3］ GHOSH B K, CHAKRA?VORTY A.Electrochemical studies of ruthenium(Ⅱ) compounds part I ligand oxidation levels［J］.Coord Chem Rev,1989,95：239.

　　［4］ Haq I, Lincoln P, Broo A, et al. Chaires, Interaction of DELTA? and LAMBDA?［Ru(phen)2DPPZ］2+ with DNA: A Calorimetric and Equilibrium Binding Study［J］.J Am Chem Soc,1995,117(17)：4788.

　　［5］ CHAIRES J B, DATTAGUPTA N, CROTHERS D M.Studies on interaction of anthracycline antibiotics and deoxyribonucleic acid: equilibrium binding studies on the interaction of daunomycin with deoxyribonucleic acid［J］. Biochemistry,1982,21(17)：3933.