HPLC法测定玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸含量
作者：李振东，徐位良，罗娇艳
【摘要】 目的 用反相高效液相色谱梯度洗脱法测定玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸的含量。方法 GraceSmart?RP18柱，乙腈?体积分数2%醋酸溶液二元梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1，检测波长278 nm，柱温为室温。结果 哈巴俄苷的平均回收率为100.4%，方法精密度RSD为1.27%（n=6）；肉桂酸的平均回收率为97.2％，方法精密度RSD为2.36%（n=6）。结论 所建方法可用于玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸的含量测定。
【关键词】 玄麦甘桔颗粒；哈巴俄苷；肉桂酸；HPLC；含量测定
Abstract:Objective To establish a new method for analyzing the contents of harpagoside and cinnamic acid in Xuanmaiganjie granula.Methods Samples were analyzed on a Grace Smart ?RP18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm）. The mobile phase consisted of acetonitrile?2% HAc under gradient elution during 0-20 min（28→39∶72→61）. The flow rate was 1.0 mL·min -1 and the detection wavelength 278 nm. Results The average recoveries for harpagosicle and cinnamic acid were 100.4% and 97.2% with RSD 1.27% and 2.36% (n=6), respectively. Conclusion The method can be used for the quantitative analysis of harpagoside and cinnamic acid in Xuanmaiganjie granula.
Key words:Xuanmaiganjie granula；harpagoside；cinnamic acid；RP?HPLC
玄麦甘桔颗粒由玄参、麦冬、甘草、桔梗4味中药组成，具有清热滋阴、祛痰利咽之功效。临床用于阴虚火旺，虚火上浮，口鼻干燥，咽喉肿痛。该产品现行标准［1］41-42只收载了定性鉴别反应，已有报道测定该制剂的甘草酸、甘草次酸的含量［2，3］，但哈巴俄苷和肉桂酸的含量测定未见文献报道。玄参为玄麦甘桔颗粒的主要药味之一，环烯醚萜苷、苯丙素苷和肉桂酸［4，5］为玄参的主要活性成分。其中,哈巴俄苷是玄参中主要的环烯醚萜苷类成分，具有抗炎、降压、抗乙肝病毒等作用［6］；肉桂酸是一种新型的诱导分化剂，具有诱导分化肿瘤细胞的作用［7］。为进一步评价玄麦甘桔颗粒的质量，本文建立了玄麦甘桔颗粒中哈巴俄苷与肉桂酸含量测定的反相高效液相色谱法，采用梯度洗脱法，具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可控制其质量。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦公司），Agilent 1100系列双元泵，Agilent 1100可变波长检测器，Agilent 1100/化学工作站。DL?360超声波清洗器（宁波石浦海天仪器厂），工作频率（4.5±0.05）kHz，输出功率240 W。
哈巴俄苷（批号：111730-200501）、肉桂酸（批号：110786-200503）均由药品生物制品检定所提供；玄麦甘桔颗粒（九寨沟天然药业集团有限公司，每包10 g，每盒20包）；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为双蒸水。
2 实验部分
2.1 样品液制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取哈巴俄苷对照品12.5 mg置250 mＬ量瓶中，加体积分数为30%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为哈巴俄苷对照品贮备液（质量浓度为50 μg·mL-1）。精密称取肉桂酸对照品13.0 mg置50 mL量瓶中，加体积分数为30%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 mL置100 mL量瓶中，加体积分数为30%的甲醇稀释至刻度，摇匀，作为肉桂酸对照品贮备液（质量浓度为26 μg·mL-1）。
2.1.2 供试品溶液的制备 取玄麦甘桔颗粒5包研碎，取约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为30%的甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，用体积分数为30%的甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，弃去初滤液，续滤液0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照液的制备 取处方组成中除玄参以外的其余成分，制成不含玄参的阴性对照品，按供试品溶液的制备方法处理，得阴性对照溶液。
2.2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱为GraceSmart ?RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈?体积分数2%醋酸溶液二元梯度洗脱：0～20 min，乙腈28%→39%，体积分数2%醋酸溶液72%→61%；流速为1.0 mL·min-1，检测波长278 nm，柱温为室温。分别取对照品溶液（哈巴俄苷浓度为10.0 μg·mL-1、肉桂酸浓度为5.2 μg·mL-1）、供试品溶液和阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，理论板数以哈巴俄苷、肉桂酸分别，都应不低于1×104，其中哈巴俄苷为10 131、肉桂酸为11 650；哈巴俄苷、肉桂酸的拖尾因子分别为0.98、0.95，保留时间分别约为10.7、15.1 min，哈巴俄苷、肉桂酸及与其他组分的分离度都大于1.5；阴性不干扰样品测定（图1）。
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线的制备 分别吸取一定量的哈巴俄苷与肉桂酸对照品贮备液，加甲醇稀释成含哈巴俄苷质量浓度为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μg·mL-1与肉桂酸质量浓度为1.3、2.6、3.9、5.2、6.5、7.8、9.1 μg·mL-1的溶液。依次进样20 μL，每个浓度测定3次以上。以峰面积（A）对对照品溶液质量浓度（ρ）进行回归，分别得回归方程A哈巴俄苷=60.30ρ+5.01（r=0.9997）；A肉桂酸 =223.24ρ+14.24（r=0.9999）。
表明哈巴俄苷质量浓度在2.5～17.5 μg·mL-1、肉桂酸在1.3～9.1 μg·mL-1与峰面积的线性关系良好。
2.3.2 稳定性试验 取供试品溶液（批号070601）在0、2、4、6、8、12 h，分别进样20 μL，记录峰面积。结果哈巴俄苷峰面积的RSD=1.57%、肉桂酸峰面积的RSD=1.68%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
A.阴性对照溶液 B.混合对照品溶液 C.供试品溶液
1.哈巴俄苷 2.肉桂酸
图1 HPLC色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms
2.3.3 重复性试验 取同一批号（批号070601）样品6份，按“2.1.2”项下方法提取、测定。结果哈巴俄苷的平均含量为67.8 μg·g-1，RSD=1.27%（n=6）；肉桂酸的平均含量为24.3 μg·g-1，RSD=2.36%（n=6）。表明分析方法精密度良好。
2.3.4 加样回收试验 精密称取玄麦甘桔颗粒（批号070601）共6份，加入相应量的哈巴俄苷和肉桂酸对照品，按“2.1.2”项下方法处理并测定，回收率。哈巴俄苷的平均回收率为100.4%、RSD=1.24%；肉桂酸的平均回收率为97.2%、RSD=2.07%。结果表明方法准确、可靠。结果见表1和表2。
表1 哈巴俄苷回收率试验结果（略）
Tab.1 Recovery of harpagoside (n=6)
表2 肉桂酸回收率试验结果（略）
Tab.2 Recovery of cinnamic acid (n=6)
2.4 样品测定 取玄麦甘桔颗粒3批，按“2.1”项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中哈巴俄苷与肉桂酸的含量，结果见表3。
表3 样品测定结果（略）
Tab.3 Results of samples determination (n=3)
3 讨论
3.1 文中曾选用不同比例甲醇?乙腈?体积分数1%醋酸水溶液［8］、乙腈?体积分数1%冰醋酸溶液［9］和甲醇?体积分数1%醋酸水溶液［10］为流动相，但基线不稳，哈巴俄苷、肉桂酸峰悬浮于基线上方，与相邻色谱峰不能分离且峰形不对称。参照药典［1］76-77及［11-13］的方法，采用乙腈?醋酸溶液梯度洗脱，经摸索乙腈?体积分数2%醋酸溶液二元梯度洗脱，时间：0～20 min，乙腈（%）：28→39，体积分数2%醋酸溶液（%）：72→61，方得满意结果。
3.2 本文考察了超声提取20、30、40、50 min对提取率的影响，结果表明，超声提取30 min含量达稳定，时间增加，含量不会增加。在超声30 min的基础上，比较直接超声、冷浸1 h 和冷浸12 h，结果无显著性差异。因此选择直接超声30 min。
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