HPLC?MS法测定不同产地冻干鲜鱼腥草中黄酮类成分的含量
【摘要】 目的 考察不同产地冻干鲜鱼腥草黄酮类活性成分的含量。方法 采用HPLC?MS法，Alltima C18柱；流动相：体积分数为0.2%的冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～20 min，5%～20% B；20～40 min，20%～20.5% B；40～50 min，20.5%～35% B；流速：0.6 mL/min；柱后分流：0.4 mL/min进质谱仪；UV和MS同时检测。结果 香港产的鱼腥草5个黄酮类成分含量都低于四川峨嵋和广东产地，四川峨嵋产地的芸香苷、金丝桃苷、槲皮苷含量均高于广东产的，而广东产地的槲皮素?3?O?β?D?半乳糖?7?O?β?D?葡萄糖苷和槲皮素?3?O?α?L?鼠李糖?7?O?β?D?葡萄糖苷含量高于四川峨嵋产地。结论 不同产地冻干鲜鱼腥草的黄酮类活性成分含量不同。
【关键词】 冻干鲜鱼腥草；HPLC?MS；黄酮；含量测定
Quantitative analysis of flavonoids in freeze?dried Houttuynia cordata from different habitats by HPLC?MS
Abstract:Objective To compare the contents of flavonoids in freeze?dried Houttuynia cordata from different habitats. Methods Samples were analyzed by HPLC?MS using an Alltima C18 column. The mobile phase consisted of 0.2% acetic acid in water (A) and acetonitrile (B) using a gradient elution program of 20% (B) in 0～20 min, 20%～20.5% (B) in 20～40 min, 20.5%～35% (B) in 40～50 min. The flow rate was 0.6 mL/min. Results The contents of five flavonoids in HongKong were higher than those in Sichuan and Guangdong Province. The contents of rutin, hyperoside and quercitroside in Sichuan Province were higher than those in Guangdong Province, while the contents of quercetin 3?O?β?D?galactopyranosyl?7?O?β?D?glucopyranoside and quercetin 3?O?L?rhamnopyranosyl?7?O?β?D?glucopyranoside in Guangdong Province were higher than those in Sichuan Province. Conclusion There are great differences in the contents of flavonoids from different habitats．
Key words: Houttuynia cordata; HPLC?MS; various cultivation locations； quantity analysis
鲜鱼腥草为三白草科Saururaceae蕺菜属植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鲜全草［1］，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效。主要用于肺脓疡、痰热咳嗽、热痢热淋、痈疮肿毒［2］。药理研究表明鱼腥草中的黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化剂、抗诱变和清除自由基等功能［3-4］。作者曾对鲜鱼腥草中黄酮类化合物的分离与鉴定进行了研究［5］。本文建立HPLC?MS法测定冻干鲜鱼腥草中黄酮类活性成分的含量方法，并对不同产地黄酮类成分含量进行比较，以期为鱼腥草资源及鲜品的合理开发利用提供理论依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100 LC?MS联用系统(美国惠普公司)，色谱数据处理由Agilent化学工作站完成。Milli?Q 纯净水发生器 (Millipore， Bedford， MA， USA)，超声波提取器（1875HTAG， CREST， U.S.A.），分析天平（型号：AB204?N，Mettler?Toledo Group）。
1.2 试剂
甲醇(分析纯)，冰醋酸、乙腈(色谱纯)均由德国 E.Merck 公司提供。
化学对照品：槲皮素?3?O?β?D?半乳糖?7?O?β?D?葡萄糖苷（1），槲皮素?3?O?α?D?鼠李糖?7?O?β?D?葡萄糖苷（2），芸香苷（3），金丝桃苷（4），槲皮苷（5）均由本实验室分离纯化得到，纯度均达到96%以上。
1.3 药材
新鲜鱼腥草药材分别采自四川峨眉，广东肇庆和香港，采收季节为8月。经香港浸会大学邬家林教授鉴定为三白草科蕺菜Houttuynia cordata Thunb。
冻干鲜品的处理方法为：新鲜药材先保存于-20 ℃冰柜中，预冻12 h，然后冷冻干燥48 h。冻干品取出后密闭保存（经测定药材冻干品的含水量约为4％～6%）。干品的处理方法按照《药典》2005版规定的常温干燥法干燥。样品处理好后，粉碎，过40目筛，保存于4 ℃冰箱备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Alltima C18，5 μm， 7.5 mm×4.6 mm (保护柱)+4.6 mm×150 mm（分析柱）。柱温：室温；流速：0.6 mL/min；柱后分流：0.4 ml/min进质谱仪；流动相：体积分数为0.2%的冰醋酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～20 min，5%～20%B；20～40 min，20%～20.5%B；40～50 min，20.5%～35%B；检测条件：UV280 nm，MS同时记录总离子流（TIC）色谱图。进样量：10 μL。
质谱条件：离子化方式为电喷雾离子化(ESI)；负离子形式；扫描范围：130～800 amu；干燥气流速（氮气）:7 L/min，干燥气温度：400 ℃；雾化气压:5 000 V; 聚焦环电压: 380 V。
5个对照品的［M+1］+ (m/z)分别为槲皮素?3?O?β?D?半乳糖?7?O?β?D?葡萄糖苷（1）627，槲皮素?3?O?α?D?鼠李糖?7?O?β?D?葡萄糖苷（2）611，芸香苷（3）611，金丝桃苷（4）465，槲皮苷（5）449，质谱图见图1。
A.槲皮素?3?O?β?D?半乳糖?7?O?β?D?葡萄糖苷； B.槲皮素?3?O?α?D?鼠李糖?7?O?β?D?葡萄糖苷； C.芸香苷； D.金丝桃苷； E.槲皮苷
图1 5个对照品的质谱图（略）
Fig.1 MS chromatograms of five standard substance
2.2 标准曲线的制备
分别精密称取各对照品适量，制成每1 mL含0.2 mg的甲醇溶液。取5个不同浓度的对照品溶液分别进样10 μL，按上述色谱条件测定蜂面积，结果以进样质量浓度为横坐标(ρ)，以峰面积值为纵坐标(A)进行线性回归，得到的回归方程见表1。
2.3 样品溶液的制备
精密称取0.5 g的样品粉末，置50 mL的容量瓶中，加体积分数为70％的甲醇至刻度，摇匀，超声30 min，室温放置30 min，过滤。取滤液2 mL，0.2 μm微孔滤膜滤过，进样10 μL。
2.4 稳定性试验
取同一供试品溶液（广东产地），在前述色谱条件下分别在0、2、4、8、24 h进样10 μL，按上述色谱条件测定含量，各对照品含量的RSD值均大于3.12%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。
表1 各对照品的标准曲线（略）
Tab.1 Validation parameters for standard curve
2.5 重复性试验
取同一供试品（广东产地）重复提取6份，按上述色谱条件测定含量，结果各对照品含量的RSD值均小于2.38%，表明重复性良好。
2.6 回收率试验
取已知含量的鱼腥草药材（广东产地）0. 5 g共5份，精密称定，分别精密加入对照品适量，按“2.3”项下方法制备，测定各标准品的含量，回收率，结果见表2。
2.7 样品测定
精密称取各样品0.5 g，按“2.3”项方法制备供试品溶液。样品含量在线性范围时直接进样10 μL，通过回归方程计算含量，所得结果见表3，色谱图见图2。
表2 回收率测定（略）
Tab.2 Recovery of assay (n=5)
表3 样品含量测定（略）
Tab.3 Contents of flavonoids in H. cordata from different habitats（n=3）
A混合标准品； B.四川； C.广东； D.香港
1.槲皮素?3?O?β?D?半乳糖?7?O?β?D?葡萄糖苷; 2.槲皮素?3?O?α?D?鼠李糖?7?O?β?D?葡萄糖苷; 3.芸香苷，4.金丝桃苷，5.槲皮苷
图2 冻干鲜鱼腥草不同产地及对照品的HPLC图（略）
Fig.2 HPLC chromatograms of different habitats of freeze?dried Houttuynia cordata and mixed standard controls
3 讨论
3.1 黄酮类化合物为鱼腥草的有效成分，药理研究表明化合物1和2具有抗氧化作用和DPPH 自由基清除作用［6-7］。化合物3，4也具有较好的抗氧化活性［8］，以此5个活性成分为指标，能较好的反映鱼腥草的质量优劣。
3.2 洗脱条件经过反复的探索，样品的HPLC色谱图中各峰分离度较好，化合物3峰有小肩峰，还需进一步改进。
3.3 本文建立HPLC?MS同时测定冻干鲜鱼腥草黄酮类活性成分含量的测定方法，结果表明不同产地冻干鲜鱼腥草黄酮类成分的含量不同，香港产的鱼腥草5个黄酮类成分含量都低于四川峨嵋和广东产地，四川峨嵋产地的化合物3，4，5都高于广东产的，而化合物1，2的含量广东产地高于四川峨嵋产地，这对于临床用药及鲜鱼腥草开发利用具有一定的指导意义。
【】
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