毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大的影响

【摘要】  目的 研究毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌肥大的影响。方法 采用正交试验设计法考察AngⅡ浓度、心肌细胞密度和AngⅡ干预时间对心肌肥大模型构建的影响，确定心肌肥大模型的构建条件，考查毛茛总苷对AngⅡ诱导的心肌肥大的影响。结果 心肌肥大模型的条件为：AngⅡ浓度为1 μmol·L-1,心肌细胞密度为2×105个·mL-1，AngⅡ干预时间为48 h。50 、100 、200 μg·mL-1毛茛总苷有抑制AngⅡ诱导的心肌肥大的作用。结论 毛茛总苷有抗心肌肥大的作用。

【关键词】  毛茛总苷；心肌肥厚；血管紧张素Ⅱ；正交试验

　　Abstract:Objective To study effects of angiotensin Ⅱ?induced  myocardial hypertrophy of total glycosides of Ranunculus  japonicus. Methods Orthogonal experiment was used to investigate effects of three factors (concentration of angiotensin Ⅱ, the density of cardiocytes, and optimal time of intervention by angiotensin Ⅱ) on establishment of myocardial hypertrophy model. And effect of ranunculin on angiotensin Ⅱ?induced myocardial hypertrophy were studied after myocardial hypertrophy model was established. Results The conditions for myocardial hypertrophy model include concentration of angiotensin Ⅱ：1μmol·L-1, the density of cardiocytes：2×105·mL-1, and optimal time of intervention by angiotensinⅡ： 48 h. 50, 100 μg·mL-1, ranunculin at 200 μg·mL-1 inhibited the process of myocardial hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ. Conclusion Ranunculin had the inhibiting effect on myocardial hypertrophy.

　　Key words:ranunculin; myocardial hypertrophy; angiotensin Ⅱ; orthogonal experiment

　　心肌肥厚是高血压病最常见的并发症之一,但其发病机制迄今尚不十分清楚。现已明确,血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ) 、肾上腺素受体激动剂、内皮素?1及某些细胞因子是导致心肌肥大的重要因子［1］,循环血中和/ 或心肌局部AngⅡ是引起心肌细胞肥大和引起心肌成纤维细胞增殖致心肌纤维化的最重要活性物质［2,3 ］,该作用可被血管紧张素Ⅱ受体亚型1 (AT1) 拮抗剂所阻断。毛茛总苷对AngⅡ所致心肌肥大有无影响,尚未见报道。为此,本实验利用体外细胞培养技术,用血管紧张素Ⅱ构建心肌肥大模型，观察毛茛总苷对血管紧张素Ⅱ致心肌肥大影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂  酶标仪（850型,Biotech Laboratories），AngⅡ（Sigma，批号：125K51011），Ⅱ型胶原酶（Invitrogen，批号：DH071），5?溴脱氧尿嘧啶（5?BrdU，Roche，批号:280879），磺基罗丹明B（Sigma?Aldrich,批号:3520-42-1）。

　　1.2  实验动物  SD乳鼠（出生1～3 d）,由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003-002，粤监证字2005A010。

　　1.3  药物制备  毛茛全草晾干切碎，85％（φ）乙醇回流提取3次，过80目筛,合并提取液，减压浓缩回收溶剂，等体积的醋酸乙酯萃取若干次至醋酸乙酯层为浅绿色。下层（水层）蒸干溶剂，得膏状物经D-101大孔树脂吸附，水洗,弃去,再用纯乙醇洗脱,收集此部位,蒸干乙醇得膏状物即毛茛总苷。毛茛总苷原液配制：取毛茛总苷膏状物用DMEM培养液溶解，配制成5, 10，20 mg·mL-1的原液，无菌过滤，备用。

　　1.4  细胞分离和培养［4］  用75%（φ）酒精消毒乳鼠，在无菌工作台中取其心脏，放入预冷的D-Hanks液中，剔除心脏周围的肺、大血管及结缔组织,剪碎心脏至沙粒状。加胰酶和胶原酶混合消化，37 ℃，6 min，用小牛血清终止消化，静置片刻，吸去上清。再加入等体积消化酶继续消化，收集上清。如此连续消化多次，收集所有的上清，1 000 r/min离心，弃去上清，用D?Hanks液再悬浮细胞，1 000 r/min离心，弃去上清。收集沉淀，用10％（φ）胎牛血清混悬，过120目细胞筛，接种至培养瓶中培养2 h后，吸出上清，调整细胞密度到1×105～4×105个·mL-1，加0.1 mmol·L-1 BrdU（终浓度）。细胞培养72 h后换成低血清培养基培养24 h即可进行下面的实验。

　　1.5  心肌肥大模型的构建  用正交实验设计法［5］考查细胞密度， AngⅡ浓度和AngⅡ干预时间3个因素对肥大心肌细胞的影响，确定心肌细胞肥大模型构建的最佳条件。实验重复2次。具体方法如下：将细胞接种至96孔中，分成9个组，按照上述正交实验设计法确定的方案对细胞加药处理。细胞培养若干时间后，取出96孔板，吸走培养基，采用SRB染色法［6］并用酶标仪测定吸光度A值。

　　1.6  形态学鉴定  将细胞按照上述实验得到的密度培养在底部置有2 cm×2 cm载玻片的直径为3.5 cm的培养皿中，分成3个组：（1）正常组：不加任何药物处理；（2）模型组：加AngⅡ孵育；（3）药物组：同时加AngⅡ和洛沙坦处理，洛沙坦的终浓度均为1 μmoL·L-1，干预48 h。苏木素－伊红染色，拍照，从形态学角度观察细胞的肥大程度。

　　1.7  抗心肌细胞肥大药物筛选  心肌细胞接种培养至96孔板中，72 h后，培养液换成5%(ρ) FBS培养24 h，对细胞分组（每组设8个复孔）加药干预：（1）正常组（加等体积的DMEM）；（2）肥大模型组：AngⅡ终浓度为1 μmol·L-1,（3）洛沙坦组：同时加AngⅡ和洛沙坦，终浓度均为1 μmol·L-1；（4）毛茛总苷组：AngⅡ终浓度均为1 μmol·L-1, 毛茛总苷浓度均为50 、100 、200 μg·mL-1，加药干预48 h后，采用SRB染色法考查各组细胞吸光度值。实验重复3次。

　　1.8  统计学处理  所有数据均以±s表示，统计学处理采用t检验,以P<0.05为差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  构建心肌肥大模型的最佳条件

　　表1  9次试验的吸收值（略）

　　Tab.1  Absorbances of nine tests

　　表1结果表明：以R值大小来判断主次因素，细胞密度是主要因素，依次是加药培养时间和AngⅡ浓度。最佳条件为A3B2C2，即AngⅡ浓度为10-6mol·L-1，细胞密度为2×105·mL-1，加药干预培养时间为48 h。这个组合在正交表中未出现，为了证明其可靠性，按A3B2C2条件进行试验，试验结果得到的吸光度值为：0.543 3，比表1中任何一组试验得到的吸光度值都大，证明所得到的最佳条件是可靠的。

　　2.2  HE染色结果（20×10）
   
　　从HE染色结果可以看出,由血管紧张素Ⅱ诱导的肥大心肌细胞（图1B）的表面积比正常组显著增大，肥大心肌细胞经洛沙坦干预48 h，心肌细胞表面积基本恢复至正常水平（图1C）。

　　2.3  毛茛总苷抗心肌肥大作用研究
   
　　各组细胞经1 μmol·L-1的AngⅡ孵育48 h后，经SRB染色的A值明显比正常组大，表明经AngⅡ诱导后的细胞总蛋白含量增高，即心肌细胞经过1 μmol·L-1的AngⅡ孵育48 h后，细胞发生了肥大。毛茛总苷50 、100 、200 μg·mL-1均具有显著抑制心肌肥大的作用，与模型组比较，差异有显著性（P<0.01）。见表2。

　　A 正常细胞组;B AngⅡ诱导的肥大细胞组;C 洛沙坦组

　　图1  乳鼠心肌细胞的苏木素-伊红染色图（20×10） （略）

　　Fig.1  Hematoxylin-eosin staining of cardiocytes from neonatal SD rats

　　表2  毛茛总苷对肥大心肌细胞的抑制作用（略）

　　Tab.2  Inhibitory effect of ranunculin on hypertrophic myocardial cell

　　与DMEM对照组比：**P<0.01;与模型组比：## P<0.01

　　3  讨论
    　　
　　本实验采用胰蛋白酶、胶原酶混合消化法及差速贴壁法，培养48～72 h，即可得到搏动性和贴壁良好的心肌细胞。［4］表明用此分离培养方法得到的心肌细胞可以用来构建心肌肥大模型。
    　　
　　心肌细胞是一种高度分化的终末细胞，一般情况下不能增殖，伴有体积或长度的增加。心肌肥大是心肌细胞和间质细胞对神经体液因素或机械牵张所作出的应答反应，这些神经体液因素包括血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）、内皮素?1（endothelin?1,ET?1）、儿茶酚胺类递质、胰岛素样生长因子?1（insulin?like grow factor?1）、肿瘤坏死因子?α等，这些是心肌肥大发生的正性调控因素。其相应的受体则成为目前心肌肥大防治的主要靶分子。血管紧张素Ⅱ与其Ⅰ型受体（AT1）结合后能够直接诱导心肌细胞肥大。心肌细胞肥大后在形态上表现为体积的增大，内在表现为细胞内的总蛋白含量、蛋白合成量和DNA合成量增加。
    　　
　　磺基罗丹明B（SRB）［7］是一种蛋白结合染料，可与碱性氨基酸结合而显色，呈现一种明亮的粉红色，用酶联免疫检测仪测定吸光度，可提供一个敏感的细胞蛋白含量的数值。SRB法避免使用放射性元素，实验方法与MTT法比较，操作所需时间更短，检测更灵敏［8］；与传统的考马斯亮蓝法、双缩脲法和lorry?酚试剂法相比，操作方法更加简单，敏感度高。本文用SRB对心肌细胞染色，以测定其吸收值，间接反映细胞内的总蛋白含量，观察毛茛总苷对肥大心肌细胞的影响。根据正交实验设计和HE染色检测确定肥大模型构建的最佳方案，并以此模型。结果显示50 、100 、200 μg·mL-1毛茛总苷具有显著的抗心肌肥大作用，与10-5mol·L-1洛沙坦抑制效应相当。
   
　　本实验结果表明，毛茛总苷在体外能抑制心肌肥大,为毛茛抗心肌肥大提供了实验基础，至于是什么成分以及毛茛总苷在相应的整体动物模型中的作用如何，还有待于进一步研究。

【文献】
  　　［1］ VIKSTROM K L, BOHLMYER T, FACTOR S M, et al. Hypertrophy,pathology, and molecular markers of cardiac pathogenesis［J］. Circ Res， 1998,82(7) ∶773 -778.

　　［2］ NEYSES L, NOUSKAS J, LUYKEN J, et al. Induction of immediate?early genes by angiotensin II and endothelin?1 in adult rat cardiomyocytes［J］. J Hyperten, 1993,11(9):927.

　　［3］ SCHORB W, BOOZ G W, DOSTAL D E, et al. Angiotensin II is mitogenic in neonatal rat cardiac fibroblasts［J］. Circ Res,1993,72 :1245-1254.

　　［4］ SIMPSON P, MCGRATH A, SAVION S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines［J］.Circ Res,1982,51(6):787-801.

　　［5］ 庄楚强，吴亚森.应用数理统计基础［M］. 2版.广东:华南理工大学出版社,2003：427-429.

　　［6］ SKEHAN P, STORENG R, SCUDIERO D,et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening［J］. J of Nat Cancer Ins,1990,82(13):1107-1112.

　　［7］ 王青青，余海.SRB显色法用于抗癌药物敏感性试验的研究［J］.科技通报，2000，16（2）：104-107.

　　［8］ HASELSBERGER K, PETERSON D C, THOMAS D G, et al. Assay of anticancer drugs in tissue culture: comparison of a tetrazolium-based assay and a protein binding dye assay in short-term cultures derived from human malignant glioma［J］. Anticancer Drug,1996,7(3):331-338.