喘息灵胶囊Ⅰ（含马兜铃）和喘息灵胶囊Ⅱ（不含马兜铃）平喘作用的比较

                         作者：邓元荣，谢振家，刘诗洪，邱腾颖  

【摘要】  目的 比较喘息灵胶囊 Ⅰ（原方，含马兜铃）和Ⅱ（新方，不含马兜铃）的平喘作用。方法 用豚鼠喷雾致喘法和豚鼠离体气管螺条法比较喘息灵胶囊二个样品的平喘作用，用量反应六点法其效价比。结果 喘息灵胶囊二个样品3个剂量均能明显延长哮喘潜伏期并对离体气管平滑肌具有松弛作用；豚鼠喷雾致喘法的效价比 Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.97（95%可信限为0.47～1.47），豚鼠离体气管螺条法的效价比 Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.98（95%可信限为0.76～1.20）。结论 喘息灵胶囊 Ⅰ（原方）和Ⅱ（新方）均有明显的平喘作用，二个样品的效价相当。

【关键词】  喘息灵胶囊 Ⅰ、Ⅱ；马兜铃；平喘作用；喷雾致喘法；离体气管螺条法

　　Abstract:Objective To compare the anti?asthmatic effects of Chuanxiling capsules I （original prescription，containing Aristolochia debilis Sieb. et Zucc ) and Chuanxiling capsulesⅡ (modified prescription，not containing Aristolochia debilis Sieb. et Zucc). Methods The antitussive effects of Chuanxiling capules I andⅡ were compared with the method of spray?induced asthma on the guinea pigs and the method of in vitro trachea on the guinea pigs, and calculate the potency ratios with the method of dosage reaction. Results All the three doses of the two capsule samples can prolong the animal’s cough latent period and relieve the in vitro trachea smooth muscle. The potency ratio under the method of spray?induced asthma is I ∶Ⅱ=1∶0.97 (95% confidence interval is 0.47～1.47). And the ratio under the method of in vitro trachea is Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.98 (95% confidence interval is 0.76～1.20). Conclusion  Both Chuanxiling capsules I andⅡ have the obvious anti?asthma effect and their potency ratios are almost the same.

　　Key words:Chuanxiling capsules I andⅡ；Aristolochia debilis Sieb. et Zucc；anti?asthma effect； method of spray?induced asthma； in vitro trachea

　　喘息灵胶囊是由中药（含马兜铃等）和化学药组成的中西药复方制剂，经国家批准［1］，临床用于哮喘，以缓解气喘、咳嗽、咳痰等症状，疗效确切。近年来，由于有关马兜铃引起慢性肾损害的报道及许多国家对马兜铃的禁用［2］，故拟将喘息灵胶囊中的马兜铃去除，观测其对平喘、止咳和祛痰的影响。本研究通过豚鼠喷雾致喘法实验和豚鼠离体气管螺条法实验观察喘息灵胶囊 Ⅰ（原方，含马兜铃）和胶囊Ⅱ（新方，去马兜铃）的平喘作用，并比较两药在平喘作用上的差异。

　　1  实验材料

　　1.1  动物   豚鼠100只,体质量300～400 g，雌雄各半，清洁级，由上海申旺实验动物养殖场提供，许可证号: SCXK (沪)2002-0012，合格证号:NO007262；实验动物室，福建卫生职业技术学院屏障系统动物实验室（SYXK(闽)2006-0004）。

　　1.2  试剂与仪器  喘息灵胶囊 Ⅰ（原方）,规格:0.29 g/粒(含马兜铃30 mg),批号:050101。喘息灵胶囊Ⅱ（新方）,规格:0.26 g/粒(去马兜铃), 批号:050109。试验中两药等效剂量比为1∶0.9,均为中试产品，由厦门建发制药有限公司提供。磷酸组胺，5 g/瓶, 上海国药集团化学试剂有限公司提供,批号:F20041224。氨茶碱，上海一平制药有限公司提供，批号：20040529。氯乙酰胆碱,5 g/片, 上海国药集团化学试剂有限公司提供,批号:Lot.No.WF20050329。盐酸异丙肾上腺素，上海禾丰制药有限公司提供，批号：20050323。yuyuE402AI多功能超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司生产，产品许可证号Q13421181ZYQ007-2。RM6240-BD生物信号采集分析系统，成都仪器厂生产。

　　1.3  统计学处理
   
　　用 SPSS 13.0进行统计分析，用单因素方差分析和生物六点法方差分析，P<0.05为差异有显著性。

　　2  方法与结果

　　2.1  豚鼠喷雾致喘法 ［3］   筛选豚鼠：取健康豚鼠，用多功能雾化器将0.1%磷酸组胺和1.0%氯乙酰胆碱等容积混合液以2 mL/min流速向密封玻璃容器（容积4 000 mL）开始喷雾，到玻璃容器内全部充满白色雾为准，将豚鼠放入其中接受喷雾15 s，喷雾终止，立即取出豚鼠，记录自喷雾起出现哮喘的潜伏期。哮喘分级：Ⅰ.呼吸加速;Ⅱ.呼吸困难;Ⅲ.抽搐;Ⅳ.翻倒。以Ⅳ翻倒为标准，潜伏期以120 s为限，超过者认为不敏感，弃除（注：动物一出现抽搐，即拉开箱门取出动物，以免动物因窒息而死亡）。
      
　　次日实验取合格豚鼠82只，体质量300～400 g，雌雄各半，随机分为8组：阴性对照组12只，其余各组10只。各给药组按剂量灌胃给药，灌胃容积均为1.5 mL/100 g bw，每天灌胃1次，连续3 d，其中喘息灵胶囊I的3个剂量组为0.75 、1.5  、3.0 g·kg-1，喘息灵胶囊Ⅱ的3个剂量组为0.68 、1.35 、2.7 g·kg-1；阴性对照组给等量生理盐水；氨茶碱组给等量蒸馏水,末次给氨茶碱20.0 mg·kg-1。末次给药前各组动物禁食给水12 h。末次给药后1  h，让豚鼠接受喷雾刺激，方法同前筛选实验，记录自喷雾起出现哮喘的潜伏期。哮喘以Ⅳ翻倒为标准。每组动物均按以上方法同样操作，每组试验结束后，必须更换溶液，以免影响因浓度而产生误差。结果见表1-3。
   
　　从表1可见, 喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ的3个剂量对0.1%磷酸组胺和1.0%氯乙酰胆碱致豚鼠气管痉挛所引起的哮喘有明显延长哮喘发生潜伏期作用，与生理盐水组比较差异有显著性 (P<0.01)，说明具有平喘作用。

　　表1  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对豚鼠喷雾致喘法的影响（略）

　　Tab.1  The comparison of the effects of Chuanxiling capsules Ⅰ andⅡ on the guinea pigs with the method of spray?induced asthma

　　与生理盐水组比较: *P<0.01

　　表2  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对豚鼠喷雾致喘法六点法方差分析（略）

　　Tab.2  The variance analysis of six?point method applied on Chuanxiling Capsules I andⅡ on the guinea pigs with the method of spray?induced asthma

　　表3  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对豚鼠喷雾致喘法效价比较（略）

　　Tab.3  The potency ratios of Chuanxiling capsules Ⅰ andⅡ on the guinea pigs with the method of spray?induced asthma

　　从表2可见,喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ二个药物间的变异无显著性（P>0.05），说明两药作用强度差别无显著性；回归间和组间变异有显著性（P<0.01），说明实验剂量比值及实验组安排妥当；偏离平行、二次曲线及反向二次曲线检验无显著性（P>0.05），说明两药的量效曲线无二次曲线关系和反向曲线关系，两线呈直线平行关系，可以计算效价。综上所述，可见本实验的可靠性检查是合格可靠的，因此可进行可信限计算。
    　　
　　分析结果表3表明，喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ二个药品，对哮喘潜伏期延长率作用的效价比 Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.97（95%可信限为0.47～1.47）。

　　2.2  离体气管平滑肌螺旋条收缩实验［3］

　　2.2.1  药物的配制  实验前24 h取喘息灵Ⅰ和Ⅱ各10.0 g和8.9 g，分别加克氏液（pH=7.1）100 mL，配成浓度为10%与8.9%溶液，放入-4 ℃冰箱内进行浸泡保存备用。次日离心取上清液并在取得的上清液基础上再用克氏液稀释10倍，即为1.0%与0.89%的受试药物溶液，测量其pH值分别为6.0和5.9。实验时分别取1.25、0.625、0.312 mL的受试药物溶液到容量为30 mL麦氏浴槽中，喘息灵胶囊Ⅰ给药3剂量组的终浓度为4.167×10-4、2.083×10-4、1.042×10-4 g/L，喘息灵胶囊Ⅱ给药3剂量组的终浓度为2.967×10-4、1.483×10-4、0.742×10-4 g/L。阴性组给予克氏液，阳性组给予盐酸异丙肾上腺素。

　　2.2.2  离体气管平滑肌螺旋条的制备  取400～500 g豚鼠，击昏，立即剪开颈部皮肤，分离气管，从甲状软骨下至气管下端分叉处将整段气管剪下，置含氧的K?H（Krebs?Henseleit）液的培养皿中，细心剔除气管周围的结缔组织，将气管剪成螺旋条状，宽度以2～3个气管环为宜（一段气管可制成2～3个螺旋条，采用拉丁法选取螺旋条做实验）。固定于容量为30  mL麦氏浴槽中，在麦氏浴槽内用(37±0.5)℃K?H液30 mL灌注，通入氧气。开启RM6240?BD多道生理信号采集分析系统，设置仪器参数，静止负荷为1 g，灵敏度为1 g，走纸速度为10.0 s/div（0.5 mm/s）。

　　2.2.3  实验方法  离体气管平滑肌螺旋条固定于麦氏浴槽中，描记正常曲线30 min，加入0.1%磷酸组胺0.05 mL (终浓度5.0×10-7 mmol·L-1)刺激，使气管平滑肌呈收缩状态，待收缩到平稳时，给予各受试药品，此时开始记录时间并描记5 min曲线，然后抑制百分率。各受试药物试验顺序采用拉丁法排序，方法同前。结果见表4-6。
   
　　抑制率=（给药前曲线高度-给药后曲线高度）/ 给药前曲线高度×100%

　　表4  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对离体气管平滑肌螺旋条收缩抑制的影响（略）

　　Tab.4  The inhibitory effects of Chuanxiling capsules I andⅡ on contracting of in vitro trachea smooth muscle

　　与克氏液组比较：*P<0.01   

　　从表4可见, 喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ的3个剂量对0.1%磷酸组胺致豚鼠离体气管平滑肌螺旋条收缩有明显抑制作用，与克氏液组比较差异有显著性(P<0.01)，说明具有解除气管平滑肌痉挛作用。
        
　　从表5可见,喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ二个药品间的变异无显著意义（P>0.05），说明两药作用强度差别无显著性；回归和组间变异有显著意义（P<0.01），说明实验剂量比值及实验组安排妥当；偏离平行、二次曲线及反向二次曲线检验无显著意义（P>0.05），说明两药的量效曲线无二次曲线关系和反向曲线关系，两线呈直线平行关系，可以计算效价。综上所述，可见本实验的可靠性检查是合格可靠的，因此可进行可信限计算。
   
　　分析结果表6表明，喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对豚鼠离体气管平滑肌螺旋条收缩抑制作用的效价比,Ⅰ∶Ⅱ = 1∶0.98（95%可信限为0.76～1.20）。

　　表5  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对离体气管平滑肌螺旋条收缩抑制六点法方差分析（略）

　　Tab.5  The variance analysis of six?point method applied on Chuanxiling capsules I andⅡ on in vitro trachea smooth muscle

　　表6  喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ对离体气管平滑肌螺旋条收缩抑制的效价结果（略）

　　Tab.6  The potency result of the inhibitory effects of Chuanxiling capsules Ⅰ andⅡ on contracting of in vitro trachea smooth muscle

　　2.3  最大耐受量（MTD）和最大给药量测定［4］  取昆明小鼠60只，雌雄各半，随机分为3组，阴性对照组、喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ给药组各20只。实验前禁食给水4 h。阴性对照组给予生理盐水，喘息灵胶囊Ⅰ和Ⅱ给药组给最大浓度（分别为33．8%、30.3%）按最大容积（0.4 mL/10 g·bw）灌胃给药1 d，1次/4 h，连续3次，密切观察初次给药后4 h内动物的中毒症状。实验结果未见有动物死亡，除给药当日见动物精神稍兴奋，活动增多，粪便稍软外，未见其他异常，次日上述情况基本恢复正常，无法测定LD50。以后每天上、下午观察动物各1次，每天称饲料量，每两天称体质量，连续7 d。7 d内动物精神行动良好，反应灵敏，呼吸平稳，口鼻未见分泌物，体质量与饲料需求量各组差异无显著性。可见该药的安全性大，急性毒性小，测定其最大耐受量（MTD）为喘息灵胶囊Ⅰ 40.56 g/kg·bw、喘息灵胶囊Ⅱ 36.36 g/kg·bw,分别相当临床用量1635.5倍、1631.5倍。

　　3  讨论
        
　　喘息灵胶囊是由含马兜铃等数味中药及组胺H1受体阻滞剂和β2受体激动剂等化学药组成的中西药复方剂，具有清肺化痰、止咳平喘的功效，多年临床用于慢性支气管炎、支气管哮喘等症，证实疗效显著。由于近年来研究发现马兜铃酸引起肾毒性［5］，而原方中含马兜铃，现临床应用受到限制。考虑到组方中马兜铃含量很小，并不一定起重要作用，去马兜铃可能并不影响该药的药效，因此进行了拆方比较分析研究。
        
　　本实验采用豚鼠喷雾致喘法和离体气管平滑肌螺旋条试验等常用的平喘药评定方法，并用生物检定的六点法进行了效价比效。六点法方差分析不但可分析组间、剂量间、平行间的变异，还可分析3种剂量与反应间的关系是直线还是二次曲线关系，与两药的量效曲线之间有无反向曲线关系，因此检验更为可靠全面［6］。实验结果证明，喘息灵胶囊 Ⅰ (原方、含马兜铃)和Ⅱ（新方、不含马兜铃）两个药物间差异无显著性，两药的剂量与作用的量效曲线非二次曲线和反向曲线，是两平行直线关系。豚鼠喷雾致喘法的效价比 Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.97（95%可信限为0.47～1.47），豚鼠离体气管螺条法的效价比 Ⅰ∶Ⅱ=1∶0.98（95%可信限为0.76～1.20）。从研究结果可看出，剔除了马兜铃所组成喘息灵胶囊新方，在平喘作用方面和原方效价相当。因此,实验结果可为新方的临床应用提供药效学的试验依据。

【】
  　　［1］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:中药成分制剂第15册［S］.北京:人民卫生出版社,1998.

　　［2］ 季恩，杨继红.马兜铃肾病研究回顾与展望［J］.云南中医中药杂志,2007,28(7):44-45.

　　［3］ 陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1996：33，649.

　　［4］ 国家食品药品监督管理局药品审评中心.2003年度药物研究技术指导原则［M］. 北京:医药科技出版社,2003： 20.

　　［5］ 周娜,李晓玫.马兜铃酸肾病研究的新进展［J］.药物不良反应杂志,2007,9(1):1-6.

　　［6］ 孙瑞元.定量药［M］.北京：人民卫生出版社，1987：235.