HPLC法测定荣筋片中橙皮苷的含量
作者：辛丹，王跃飞，王强，潘桂湘
【摘要】 目的 建立荣筋片中橙皮苷的HPLC含量测定方法。方法 采用Agilent C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-0.3%磷酸（体积比22∶78）作为流动相，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长为283 nm，柱温为35 ℃。结果 在0.0655～2.096 μg范围内,进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，r=0.9999，平均回收率为99.3%，RSD为0.84%（n=6）。结论 本法灵敏、简便、准确，重现性好，可用于荣筋片的质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；荣筋片；橙皮苷
Abstract:Objective To determine the content of aurantiamarin in Rongjin tablets by HPLC.Methods The analysis was carried out on a Agilent C18 column (4.6 mm×250 mm，5 μm). The mixture of acetonitrile-0.3% phosphoric acid (22∶78) was used as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was at 283 nm. The column temperature was at 35 ℃.Results The calibration curve showed a linearity within the range of 0.0655～2.096 μg( r=0.9999). The average recovery of this method was 99.3% and the RSD 0.84% (n=6). Conclusion The method is sensitive,simple,accurate and reproducible for the quality control of Rongjin tablets.
Key words:HPLC; Rongjin tablets; aurantiamarin
荣筋片为天津中医药大学第二附属的医院制剂，适用于严重的关节变形和强直性脊柱炎等病症的复方制剂，临床实验疗效显著，主要由蒺藜、沙苑子、陈皮、当归、续断、熟地黄等药物组成，具有补肾通督、养血柔筋、通络止痛的作用。方中陈皮的主要成分橙皮苷具有较强的抗炎作用［1］，且在中药新药的研发中,橙皮苷常常被选为指标成分而用于定性和定量研究。因此，为了有效控制荣筋片的内在质量，选取方中陈皮所含的橙皮苷作为质控指标，采用HPLC法测定其含量，结果满意。
1 仪器与材料
仪器：Waters2695液相色谱系统：四单元数码梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Waters2487 DAD检测器、Empower工作站；METTLER TOLEDO AX205（瑞士）十万分之一天平；BP121S万分之一天平（瑞士沙脱利斯公司）。
试药试剂：荣筋片（批号：0611013，0611014），天津中医药大学第二附属医院制剂室提供；橙皮苷对照品（批号：110721-200512）购于药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，水为高纯水。其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，采用Agilent C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.3%磷酸（体积比22∶78），检测波长为283 nm，流速为1.0 mL/min，采用35 ℃柱温，理论塔板数按橙皮苷色谱峰不低于3 000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品适量，加甲醇制成0.02 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取荣筋片数片，研细，取约1 g，精密称定，置100 mL三角瓶中，加甲醇25 mL，称重，加热回流处理20 min，取出放冷，称重，补甲醇至原量，摇匀，过滤（0.45 μm微孔滤膜），续滤液作为供试品溶液。
2.4 阴性对照溶液的制备
原方去陈皮药材，按制剂工艺进行制备，得缺陈皮的阴性制剂。取阴性制剂1 g，按“2.3”项下操作，制备阴性制剂对照液。
2.5 专属性试验
按“2.1”项下的色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：橙皮苷对照品和供试品色谱图中橙皮苷峰与其他组分峰基线分离，分离度大于1.5，保留时间为9.342 min；阴性对照色谱图中与橙皮苷对照品以及供试品色谱图中相对应的保留时间处无色谱峰出现，表明其他组分对橙皮苷的测定无干扰,见图1。
A.对照品; B.样品; C.阴性对照（缺陈皮）
图1 HPLC色谱图（略）
Fig.1 HPLC Chromatograms
2.6 线性关系考察
精密称取于40 ℃真空干燥至恒重的橙皮苷对照品5.24 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成橙皮苷标准贮备液（209.6 μg/mL）。分别配成209.6、104.8、52.4、26.2、13.1、6.55 μg/mL的系列对照品溶液，分别吸取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，以峰面积（A）为纵坐标，对照品质量浓度（ρ）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A＝16603ρ＋9628.4，r=0.9999，橙皮苷质量浓度在0.0655～2.096 μg/mL之间呈良好的线性关系。
2.7 精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液，连续进样6次，测定橙皮苷峰面积积分值，RSD为0.13%（n=6），表明精密度良好。
2.8 稳定性试验
按“2.3”项下操作制备1份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12 h测定橙皮苷面积，RSD为0.48%，结果显示供试品溶液在0～12 h内基本稳定。
2.9 重复性试验
取同一批号供试品（批号0611013）6份，各约1 g，精密称定，分别按“2.3”项下操作，制备供试品溶液，测定含量，平均含量为1.191 mg/g，RSD为1.1%（n=6），表明该方法的重复性较好。
2.10 加样回收率试验
取已知含量的制剂（批号0611013，含量为1.191 mg/g），进行加样回收率试验。取数片荣筋片，研细，约0.5 g，精密称定，置25 mL三角瓶中，加入质量浓度为209.6 μg/mL的标准贮备液适量，加入甲醇约25 mL，称重，加热回流20 min，取出放冷，称重，补甲醇至原量，摇匀，过滤（0.45 μm微孔滤膜），依法测定，橙皮苷平均回收率为99.3％，RSD为0.84％。结果见表1。
表1 橙皮苷加样回收率试验结果（略）
Tab.1 Results of recovery test
2.11 供试品含量测定
分别按“2.3”项下操作，制备不同批号（0611013，0311014）的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果2个批号样品所测得的含量分别为1.21、1.18 mg/g。
3 讨论
3.1 色谱条件的选择
根据2005版《药典》收载的陈皮药材中橙皮苷的测定条件［2］，本实验首先考察流动相为甲醇-0.3%磷酸（体积比35∶65）的检测效果，结果在此条件下色谱峰较宽，峰形不理想，于是根据调整流动相为乙腈-0.3%磷酸（体积比22∶78）［3］，此时橙皮苷色谱峰尖锐、对称。但此条件下阴性样品中有干扰峰存在，尝试将流动相比例改变为19∶81、20∶80、21∶79、23∶77均未能排除干扰，但将柱温由25 ℃升至30 ℃时，干扰有所改善，当调节柱温至35 ℃时，阴性样品中干扰排除，从而确定色谱条件。
3.2 样品处理方法的选择
本实验在样品处理方法选择时，文献［4-5］，对加热提取和超声处理两种方法进行比较，结果显示加热回流法的提取效果要好于超声法。实验中还对回流溶剂甲醇的用量（25 mL、50 mL）以及回流时间（10、20、30 min）的提取效果进行考察，最终确定25 mL甲醇，回流提取20 min效果最好。
【参考文献】
［1］ 张冬松,高慧媛,吴立军.橙皮苷的药理活性研究进展［J］.中国中药,2006,8(7):25-26.
［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部［S］.北京：化学出版社，2005：132.
［3］ 饶春恺，谭忠军,宋军.HPLC测定参苓健脾胃颗粒中橙皮苷的含量［J］.中成药,2006,28(10):1542-1543.
［4］ 袁金斌，周志炎.HPLC测定陈皮提取物及制剂中橙皮苷的含量［J］.中成药,2006,28(3):455-456.
［5］ 尚远宏,刘圆,石圣洪，等.RP-HPLC测定参仁强体胶囊中橙皮苷的含量［J］.华西药学杂志,2007,22(1):72-73.
