HPLC法测定菌毒清颗粒中丹酚酸B的含量
作者：范辉，宋粉云，钟兆健，肖若媚
【摘要】 目的 测定菌毒清颗粒中丹酚酸B的含量。方法 采用反相高效液相色谱法，Diamonsid TM C18柱，甲醇-乙腈-0.5%甲酸（体积比31∶10∶59）为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长286 nm，柱温为30 ℃。结果 丹酚酸B平均回收率为101.5%，RSD为1.95%（n=6）。结论 该法可用于菌毒清颗粒中丹酚酸B的含量测定。
【关键词】 菌毒清颗粒；丹酚酸B； HPLC；含量测定
Abstract:Objective To determine the content of Salvianolic acid B in Junduqing granules. Methods A RP-HPLC method was established. The chromatographic column was Diamonsil-C18. The mobile phase was methanol-acetonitrile -0.5%formic acid（31∶10∶59） The flow rate was 1.0 mL·min-1,and the detection wavelength was 286 nm. Results The average recovery for salvianolic acid B was 101.5%,precision of the method was 1.95%(RSD,n=6). Conclusion The method can be used for quantitative determination of Junduqing granules.
Key words:Junduqing granules；salvianolic acid B；RP-HPLC；Assay
菌毒清颗粒是制剂，由板蓝根、穿心莲、玄参、茜草、丹参、金银花提取制成，具有清热解毒、抗菌消炎、抗病毒作用。临床用于细菌、病毒感染疾病，如呼吸道、胃肠道、泌尿系统的感染EB病毒阳性的患者。该产品现行标准只收载了定性鉴别反应，有报道采用HPLC法测定其中穿心莲内酯、哈巴俄苷的含量［1,2］，但丹酚酸B含量测定未见文献报道。为进一步评价菌毒清颗粒的质量，本文建立了菌毒清颗粒中丹酚酸B含量测定的反相高效液相色谱法，该法具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于该产品的质量控制。
1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦公司），Agilent 1100系列双元泵，Agilent 1100可变波长检测器，Agilent 1100/化学工作站。DL-360超声波清洗器（宁波石浦海天仪器厂），工作频率(4.5±0.05) kHz，输出功率240 W。
丹酚酸B对照品（药品生物制品检定所，111562-200504），菌毒清颗粒（中山市人民医院），甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，水为双蒸水。
2 方法与结果
2.1 样品液制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取五氧化二磷减压干燥器中干燥24 h的丹酚酸B对照品10.00 mg，置50 mL棕色量瓶中，加体积分数为75%的甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密移取10 mL，置50 mL棕色量瓶中，用体积分数为75%的甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（浓度为40 μg·mL-1）。
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取菌毒清颗粒样品约4 g，置具塞锥型瓶中，精密加入体积分数为75%的甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，称重，用体积分数为75%的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，续滤液0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。
2.1.3 阴性对照液的制备 取处方组成中除丹参外的其余成分制成不含丹参的阴性对照品，按“2.1.2”项下的制备方法处理得阴性对照液。
2.2 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为 Diamonsil-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪马公司），甲醇-乙腈-0.5%甲酸（体积比31∶10∶59）为流动相，流速为1.0 mL·min-1，检测波长286 nm，柱温为30 ℃。分别取对照品溶液（丹酚酸B浓度为12 μg·mL-1）、供试品溶液和阴性对照溶液10 μL注入色谱仪，理论板数以丹酚酸B应不低于5 000；丹酚酸B的拖尾因子为0.94，保留时间约为25 min，丹酚酸B与其他组分可基线分离；阴性样品不干扰样品测定（图1）。
1.丹酚酸B A.对照品 B.样品 C.阴性样品
图1 丹酚酸B对照品、样品及阴性的高效液相色谱图（略）
Fig 1 HPLC chromatograms of salvianolic acid B (A) and sample (B) and negative (C)
2.3 方法学考察
2.3.1 标准曲线制备 分别吸取一定量的丹酚酸B对照品贮备液，加体积分数为75%的甲醇稀释成丹酚酸B浓度为2、4、8、12、16、20、24 μg·mL-1的溶液。依次进样10 μL，每个浓度测定3次以上。以峰面积（A）对对照品溶液质量浓度（ρ）进行回归，得丹酚酸B回归方程为A=9.85ρ-1.25，r＝0.9997。表明丹酚酸B质量浓度在2～24 μg·mL-1之间与峰面积线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 取质量浓度为12 g·mL-1的丹酚酸B对照品溶液10 μL连续测定5次，其峰面积的平均值为115.9，RSD为1.97%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液（20060809）在0，2，4，6，8 h 分别进样10 μL，记录峰面积，结果4 h峰面积的RSD=2.79%，8 h峰面积的RSD=7.86%，表明供试品溶液在4 h内稳定，超过4 h不稳定，所以样品配制后应尽快测定。
2.3.4 重复性试验 取同一批号（20060809）样品6份，照“2.1.2”方法处理并测定，结果丹酚酸B平均含量为0.076 mg·g-1，RSD为2.26%。表明分析方法精密度良好。
2.3.5 加样回收试验 精密称取同一批号样品（20060809）共6份，精密加入丹酚酸B对照品贮备液3.8 mL，照“2.1.2”方法处理并测定，回收率，结果见表1。丹酚酸B平均回收率为101.5%，RSD=1.95%。结果表明本方法准确可靠。
表1 丹酚酸B回收率试验结果（略）
Tab.1 Results of recovery test
平均回收率=101.5%, RSD=1.95%
2.4 样品测定 取菌毒清颗粒3批，照“2.1.2”方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液（12 μg·mL-1）与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，计算样品中丹酚酸B的含量，结果见表2。
表2 样品中丹酚酸B测定结果（略）
Tab.2 Results of determination of salvianolic acid B in sample
3 讨论
3.1 丹参中有效成分分有脂溶性和水溶性两类，本品中丹参采用水提工艺，而丹酚酸B为丹参中主要水溶性活性成分［3］，且其含量较高，所以确定其为含量测定指标。曾尝试以甲醇-乙腈-甲酸-水（体积比30∶10∶1∶59）［4］52为流动相，但分离效果不好，且峰型不对称，改用本文流动相，方得满意结果。曾以水［4］394为溶剂提取，但含量远远低于以体积分数为75%的甲醇［4］为溶剂的提取率。以体积分数为75%的甲醇为溶剂，进行了超声提取与回流提取的对比研究，结果表明超声提取30 min含量达稳定，且提取率高于回流提取，因此选择体积分数为75%的甲醇为溶剂，超声提取30 min。
3.2 ［5］报道丹酚酸B不稳定，实验过程中，我们也发现丹酚酸B对照品及样品溶液都很不稳定，因此对照品最好低温、避光保存，样品溶液提取后最好立即测定，以保证测定结果的准确度。
3.3 从表2结果可知，不同批号样品丹酚酸B含量有较大差异，可能原因有生产时所投药材质量不稳定，或生产工艺提取时不够合理，因此控制中成药的质量首先应控制药材质量，同时要进一步对生产工艺进行研究，才能生产出质量稳定、可控的中成药。
【文献】
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