广藿香愈伤组织诱导和分化再生植株的研究
作者：林小桦，贺红，吴立蓉，张燕玲，刘星
【摘要】 【目的】开展广藿香愈伤组织的诱导及分化再生植株的研究，建立高效的组织培养再生系统。【方法】以广藿香叶片、带节茎、不带节茎及根尖为材料进行离体培养，筛选影响愈伤组织诱导、增殖及分化的因素。【结果】6?苄氨基嘌呤(BA)或N?苯基?N??1?2?3?噻二唑?5?脲(TDZ)与α?萘乙酸(NAA)配合有利于愈伤组织的诱导，BA的适宜浓度为0?2～0?5mg/L；4种外植体中，带节茎及不带节茎较易诱导出愈伤组织。BA和NAA配合使用能较好地促进愈伤组织的增殖；培养30d的愈伤组织较60d的具有更强的增殖和分化能力。BA有利于愈伤组织的分化；叶片诱导的愈伤组织分化能力较强。【结论】建立了高效的广藿香愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生体系。
【关键词】 广藿香/生长和发育；离体培养；愈伤组织
Abstract: ObjectiveCallus induction and plantlets regeneration of Pogostemon cablin(Blanco)Benth. are studied to establish a high?efficiency regeneration system for tissue culture.MethodsThe leaf segments, nodular stem segments, stem segments and root tips from Pogostemon cablin(Blanco)Benth. were cultured in vitro. The factors which affect the induction，multiplication and differentiation of callus were studied. ResultsBenzylaminopurine (BA) or thidiazuron (TDZ) combined with α?naphthylacetic acid (NAA) was helpful to induce callus. The optimal concentrations of BA were 0?2～0?5mg/L. Nodular stem segments and stem segments were the most suitable explants for callus induction. The medium containing BA and NAA promoted the multiplication of callus. The multiplication rate and differentiation rate of 30?day callus were much higher than those of 60?day callus. BA was helpful to induce callus differentiation. The callus from leaf segments exerted a higher differentiation rate. ConclusionA high?efficiency regeneration system of callus induction and plant regeneration from Pogostemon cablin(Blanco)Benth.has been established.
Key words:POGOSTEMON CABLIN(BLANCO) BENTH./growth & development;IN?VITRO CULTURE;CALLUS
广藿香［Pogostemon cablin (Blanco) Benth.］为唇形科刺蕊草属植物，以干燥地上部分入药，其性辛、微温。具有芳香化湿，开胃止呕，发表解暑的功效［1］。广藿香为广东道地药材，“十大广药”之一，是多种著名中成药“藿香正气丸”、“藿胆丸”等以及中药制剂“抗病毒口服液”的主要原料。广藿香原产于菲律宾、马来西亚等国，最早自宋代引入我国，栽培悠久。广藿香生产中面临青枯病的危害，该病由青枯菌（Ralstonia Solanacearum）侵染所致，为典型的维管束病害［2~3］。在我国产区栽培的广藿香，罕见开花结实［4］，长期以来，生产上采用扦插繁殖，病原体通过无性繁殖传递，且逐代积累，危害越来越严重，迫切需要进行抗病品种的选育。近年来，基因转移及人工诱变等改良药用植物农艺性状的技术，为广藿香抗病育种提供了可能，而要开展相关的研究，首先要建立高效的组织培养再生系统。本文以广藿香多种外植体为材料，筛选影响广藿香愈伤组织诱导、增殖及分化的多种因素，以期建立高效的愈伤组织诱导及分化再生植株的离体再生系统，为遗传转化及人工诱变育种奠定基础，现报道如下。
1材料和方法
1?1材料试验
材料采自广州中医药大学药圃，选择生长健壮、无病虫害的广藿香单株，取其顶芽、带节茎及叶片；经蒸馏水冲洗干净后，用体积分数为70%乙醇浸泡30s，转入1g/L的HgCl2溶液浸泡消毒10min，再用无菌水漂洗5～8次，把残留HgCl2漂洗干净，接种于 Murashge and Tucker（MT）+0?2mg/L 6?苄氨基嘌呤(BA)培养基上，诱导丛芽的生成，待丛芽长出后将其移至MT培养基中培养，试管苗长至5～7cm时即可作材料使用。
1?2方法
1?2?1外植体培养
取广藿香试管苗的叶片、带节茎、不带节茎及根尖为外植体进行培养。外植体在培养基中的放置方式为：叶片及根尖平放，带节茎及不带节茎为形态学下端下插。每种处理接种外植体数为30块左右，设置3次重复。
1?2?2愈伤组织的诱导
增殖以广藿香叶片及带节茎等诱导愈伤组织，选取未分化出芽的愈伤组织接种至增殖培养基中。每种处理一般接种30块愈伤组织，设置3次重复。诱导及增殖培养基即以MT培养基为基础，根据试验要求添加不同浓度的6?苄氨基嘌呤(BA)、α?萘乙酸(NAA)、N?苯基?N'?1?2?3?噻二唑?5?脲(TDZ)及二氯苯氧乙酸(2?4?D)等植物激素组成。
1?2?3愈伤组织的分化
以实验中诱导的愈伤组织为材料，接种至分化培养基中培养。每种处理一般接种30块愈伤组织，设置3次重复。分化培养基以MT为基础培养基，根据试验要求添加不同浓度的BA、6?糠氨基嘌呤(KT)、NAA、3?吲哚乙酸(IAA)、TDZ及2?4?D等植物激素。
1?2?4无根苗的诱导
生根及移栽将愈伤组织分化获得的再生苗接种至生根培养基MT+ 0?2mg/LIBA中，进行诱导生根，生根后进行炼苗和移栽。
1?3培养条件
培养室温度保持（26±1）℃，每天光照12h，光照强度为2 500～3 000Lx。
2结果与分析
2?1愈伤组织的诱导
以广藿香试管苗的叶片及带节茎等为材料，成功诱导出愈伤组织（图1-a，彩图见第200页），并考察了不同植物激素及不同BA浓度对愈伤组织诱导的影响，同时，观察了不同外植体诱导愈伤组织能力的差异，以找出适合广藿香愈伤组织诱导的培养基及外植体种类。
2?1?1不同植物激素对愈伤组织诱导的影响
以广藿香的带节茎和不带节茎为材料，设置不同植物激素及不同激素组合进行试验。结果显示，不添加任何植物激素及单独使用细胞分裂素（BA、TDZ）未能诱导出愈伤组织，单独使用生长素（NAA、2?4?D）诱导出的愈伤组织灰白色，呈水浸状，其生长势较差。细胞分裂素与生长素结合，能成功诱导出愈伤组织，愈伤组织呈乳白色或灰白色，半透明、疏松状，生长势较好。如BA和NAA结合，培养10d后，100％的外植体产生愈伤组织；BA和2?4?D配合使用时，10d后愈伤组织诱导率达85%以上，15d后诱导率为100％；TDZ和NAA或2?4?D配合使用，10d后愈伤组织诱导率为80%以上，15d后诱导率均为100％，含有2?4?D的培养基中愈伤组织的生长势较含有NAA处理者稍好，愈伤组织颜色更深，为灰白色。带节茎和不带节茎培养，均能成功诱导出愈伤组织，在培养10d时，带节茎愈伤组织诱导率略高于不带节茎，其生长势亦较好。添加2?4?D诱导的愈伤组织，在愈伤组织培养一段时间后，会出现褐化现象，且部分死亡。因此愈伤组织诱导时，采用BA或TDZ与NAA结合较好，结果见表1。表1不同植物激素对愈伤组织诱导的影响（略）注：－ 无愈伤组织，+ 差，++ 一般，+++ 较好，++++ 旺盛
2?1?2不同浓度BA对愈伤组织诱导的影响
以广藿香带节茎为材料，设置不同浓度的BA(0、0?1、0?2、0?5mg/L)与0?5mg/LNAA配合使用，诱导愈伤组织，统计接种15d后的愈伤组织诱导率和生长势，比较不同BA浓度对愈伤组织诱导的影响。结果表明，不添加植物激素或单独使用细胞分裂素BA未能产生愈伤组织，适当浓度的BA和NAA配合，则能较好地诱导出愈伤组织，BA的适宜浓度为：0?2～0?5mg/L，其中，浓度为0?2mg/L时，愈伤组织的生长势最好。
2?1?3不同外植体诱导愈伤组织能力的差异
将广藿香试管苗的4种不同外植体：叶片、带节茎、不带节茎及根尖，接种至MT+ 0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA培养基中，观察不同外植体诱导愈伤组织能力的差异。结果表明：一般接种15d后4种外植体均能产生愈伤组织，愈伤组织诱导率均达100％。但不同外植体诱导的愈伤组织生长势表现明显的差异。带节茎诱导的愈伤组织生长势旺盛，愈伤组织黄白色，疏松；不带节茎诱导的愈伤组织生长势较好，愈伤组织黄白色，疏松；叶片诱导的愈伤组织生长势一般，颜色为浅绿色，致密；根诱导的愈伤组织生长势较差，愈伤组织灰白色，硬脆。在愈伤组织的分化实验中还观察到，叶片诱导的愈伤组织在短时间内分化出大量的芽；带节茎和不带节茎诱导的愈伤组织分化出芽的时间较晚，培养一段时间后可获得量较多的愈伤组织；根诱导的愈伤组织不分化出芽，培养时间超过30d后即出现褐化现象。
2?2愈伤组织的增殖
广藿香外植体培养能成功诱导出愈伤组织，但由于原代培养获得的愈伤组织的量较少，为了能够在较短的时间内获得较多的愈伤组织，以便能分化出更多的再生植株，因而设置了愈伤组织增殖试验。
2?2?1不同植物激素对愈伤组织增殖的影响
将带节茎接种于MT+0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织，30d后取愈伤组织为材料，接种至以下4种培养基中：MT+ 0?2mg/LBA、MT+ 0?02mg/LTDZ、MT+0?05mg/L 2?4?D及MT+0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA，观察愈伤组织的增殖情况。表2结果表明，愈伤组织在只含有BA或TDZ的培养基中难以生长，愈伤组织呈浅绿色，质地致密；在含有2?4?D的培养基能部分增殖，愈伤组织灰白色，质地疏松；在同时含有BA和NAA的培养基中生长良好，增殖较快，愈伤组织白色，质地疏松。可见，2?4?D、BA和NAA的配合使用均能较好地促进愈伤组织增殖，但后期的分化试验结果表明，在含2?4?D培养基上增殖的愈伤组织难以分化，因此，BA和NAA配合使用，较有利于广藿香愈伤组织的增殖。表2不同植物激素对愈伤组织增殖的影响（略）
2?2?2愈伤组织培养时间对增殖的影响
将广藿香带节茎接种于MT+0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织，分别于30d和60d以后取愈伤组织为材料，接种至同样成分的新鲜培养基中。30d的愈伤组织在新培养基中能继续生长，增殖较多，同时，培养20～25d后有少量愈伤组织于原培养基上分化出芽；60d的愈伤组织在新培养基上难以生长，较之30d的愈伤组织增殖明显较少，愈伤组织为灰白色，培养30d后，愈伤组织颜色变褐，且未见分化现象。可见，愈伤组织培养时间的长短，直接影响其细胞增生的能力，随着愈伤组织培养天数的增加，逐渐出现老化现象，活力降低，易于褐化，难以继续培养。
2?3愈伤组织的分化
将获得的广藿香愈伤组织转至分化培养基，能成功诱导出芽（图1-b，彩图见第200页），在愈伤组织分化试验中可观察不同植物激素对分化的影响以及不同外植体诱导愈伤组织分化能力的差异。
2?3?1不同植物激素对愈伤组织分化的影响
以带节茎为材料，接种至MT+0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织， 30d后转接至分化培养基。从表3中可知，愈伤组织在各种培养基中的分化情况有所不同，在不含激素的MT培养基中，15d后愈伤组织分化率为33?33%，分化的芽少，小芽部分出现玻璃化，且叶片发黄；在含KT、TDZ或IAA的培养基中，愈伤组织15d后的分化率为42%～52%，其分化芽的情况较为相似，小芽数目较多，芽的质量较好；在含BA的培养基中，愈伤组织的分化率最高，15d后达80?95%，与MT培养基中的愈伤组织分化率比较有显著性差异（P＜0?05），且分化出的芽数多，芽的质量好，生长较旺盛；在含有2?4?D的培养基中，愈伤组织的分化率最低，仅9?53%的愈伤组织分化出芽，且大多芽玻璃化。结果表明，在多种激素中，BA有利于愈伤组织的分化，其分化率最高，分化出的芽数亦较多，且生长良好。表3不同植物激素对愈伤组织分化的影响（略）
2?3?2不同外植体诱导的愈伤组织分化能力的差异
将广藿香试管苗的4种不同外植体叶片、带节茎、不带节茎及根尖，接种至MT+0?2mg/LBA +0?5mg/LNAA培养基中诱导愈伤组织，30d后将愈伤组织转接至分化培养基MT+ 0?2mg/LBA中，统计愈伤组织培养15d后的分化率。从表4可以看出，叶片诱导的愈伤组织分化率最高，达100%，分化出大量的芽；带节茎和不带节茎诱导的愈伤组织分化率分别为86?67%和83?33%；根尖诱导的愈伤组织不分化。结果表明，叶片、带节茎和不带节茎诱导的愈伤组织均能较好地分化出芽，根诱导的愈伤组织难以分化。表4不同外植体诱导的愈伤组织分化能力的差异（略）
2?4无根苗诱导生根及移栽
将获得的再生苗接种至生根培养基中，接种10d后开始生根，15d时生根率达100%（图1-c，彩图见第200页）。长出的根生长旺盛，植株生长良好。待试管苗生长至6～7cm长时，挑选健康的试管苗进行驯化炼苗，让幼苗适应外界的环境，然后移栽到露天种植，成活率达到90％以上（图1-d，彩图见第200页）。
3讨论
广藿香外植体诱导愈伤组织，再经体胚发生再生植株的研究，已有成功的报道，张家明等［5］以广藿香的叶片为外植体诱导愈伤组织，研究了广藿香愈伤组织的悬浮培养，获得了大量的试管苗。肖省娥等［6］采用广藿香的叶片及带节茎诱导愈伤组织，获得了再生植株。现有的研究主要是以叶片和带节茎为材料，且对于影响愈伤组织诱导及分化的因素缺乏系统的研究，同时有关愈伤组织增殖方面的研究还未见报道。本试验以叶片、带节茎、不带节茎及根尖为材料，系统地研究了影响愈伤组织诱导及分化的因素，同时考察了不同因素对愈伤组织增殖的影响，结果表明，取带节茎或不带节茎接种于含BA和NAA的培养基中较易诱导出愈伤组织。同时，BA和NAA配合使用能较好地促进愈伤组织的增殖。培养天数为30d的愈伤组织具有较强的增殖和分化能力。在愈伤组织的分化实验中，BA有利于愈伤组织的分化；叶片诱导的愈伤组织分化能力较强。通过本实验，我们建立了广藿香高效的愈伤组织诱导和分化再生植株的体系。大多数的高等植物的各种器官，离体后在适当的环境下都能产生愈伤组织［7］。愈伤组织是指植物局部创伤后或在组织培养中，当已分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织结构、无器官分化的薄壁细胞团。在植物组织培养中，愈伤组织可由外植体诱导产生，在一定条件下，可再分化出具一定结构及功能的器官，如根、茎、胚状体或重新形成完整的植株。研究表明，植物离体培养中通过器官发生和体细胞胚胎发生再生植株，通常被认为是单细胞起源的［8］。因此，广藿香离体器官经遗传转化或诱变试验处理后，再经愈伤组织诱导再生的植株，由于是单细胞起源的，可避免嵌合体的产生，从而可能为新品种选育提供有价值的种质材料。
【】
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