益肾汤对实验性IgA肾病模型小鼠肾组织转化生长因子β1表达的影响

                作者：万启军，何永成，石成钢，洪国保，胡斌，栾韶东

【摘要】  【目的】观察益肾汤对实验性IgA肾病（IgAN）模型小鼠肾组织转化生长因子β1（TGF?β1）表达的影响。【方法】选用BALB/c小鼠，采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B方法复制小鼠IgAN模型，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应（PAS）染色及免疫荧光检查，确定造模成功后随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组（剂量分别为0?1、0?05g·kg-1·d-1），并设正常对照组；采用荧光定量聚合酶链反应（FQ?PCR）法检测各组小鼠肾组织TGF?β1mRNA表达，免疫组化法检测各组肾组织TGF?β1含量。【结果】模型组肾组织TGF?β1mRNA表达及TGF?β1含量均显著升高（Ｐ＜０?０５）；益肾汤高、低剂量组肾组织TGF?β1mRNA表达及TGF?β1含量均显著降低（Ｐ＜０?０５）。【结论】益肾汤IgAN的作用与抑制肾组织中TGF?β1的分泌及其mRNA表达有关。

【关键词】  益肾汤/药；IgA肾病/中药疗法；肾/病理学；转化生长因子β；疾病模型，动物；小鼠

研究证实细胞因子在IgA肾病（IgAN）的发生过程中起重要作用，其中，转化生长因子β1（TGF?β1）是公认的最重要的致纤维化因子［1］。本研究观察了TGF?β1在实验性IgAN小鼠肾组织中表达的特点及中药方剂益肾汤对TGF?β1的影响，现报道如下。

　　1材料与方法

    1?1益肾汤组方及制备益肾汤组成：黄芪15g、生地20g、牡丹皮10g、熟地15g、赤芍10g、当归10g、山药15g、茯苓15g、山茱萸15g、金樱子15g、枸杞子15g、白茅根30g、女贞子15g、旱莲草15g、仙鹤草20g。按照“人—鼠用药剂量转换公式”，浓缩成高浓度（相当于成人剂量的2倍）及低浓度（相当于成人的每日用量）2种剂型，原液装瓶，高压消毒后密封保存，备用。

    1?2实验动物BALB/c小鼠60只，鼠龄8～10周，体质量18～22g，雌性。由中山大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(粤)2004?0011，动物批号：NO?0018045，粤监证字：2006A003。

    1?3主要试剂与仪器牛血清白蛋白（BSA）由深圳晶美生物有限公司提供，批号：RF101?010；POINT GV20 (BAIHUI);POINT SP6 (SANYINJIAO)葡萄球菌肠毒素B（SEB）由军事医学院微生物流行病研究所提供；Trizol试剂（Invitrogen公司）；Primer express 2?0 软件（美国Applied Bio?system Inc.）；PE 9600型PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）试剂盒（德国QIAGEN 公司）；脱氧核糖核苷酸（dNTPs）（10mmol/L，华美公司）；PE 7000型荧光定量仪（美国Perkin Elmer公司）；PCR buffer（美国ABI公司）；dNTPs （25mmol/L,Sigma公司） ；荧光探针（10pmol/μL，上海生工）；Taq 酶（美国ABI公司）；德国KONTRON IBAS 2?5全自动图像分析系统。

    1?4造模与分组按［2］方法复制小鼠IgAN模型：隔日灌服200mg/kgBSA，6周后按20mg/kg每日1次定期尾静脉注射BSA连续3d。8周时按0?5mg/kg尾静脉注射SEB，每周1次，连续3周，观察至12周末。造模第5周末，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应（PAS）染色及免疫荧光检查，并与正常小鼠对照，确定IgAN模型成功后，随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组，并设正常对照组；益肾汤高、低剂量分别以0?1、0?05g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，模型组、正常对照组灌服等容积蒸馏水，每日1次，均连续7周。

    1?5荧光定量聚合酶链反应法（FQ?PCR）检测各组小鼠肾组织TGF?β1mRNA的表达

    1?5?1肾组织RNA的提取取肾组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol1mL，冷冻匀浆，转置于1?5mLEppendorf 管，加入氯仿0?2mL，盖紧盖子，用力摇动15s，15℃～30℃孵育2～3min，4℃、12 000r/min离心15min；取上清液至另一个1?5mLEppendorf管，加与上清液等容积的异丙醇，15℃～30℃孵育样品10min，4℃、12 000r/min离心10min；弃上清液，体积分数75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、7 500r/min离心5min；弃乙醇，空气或真空干燥5～10min（不要完全干燥），加焦碳酸二乙酯水（DEPC）溶解RNA，-80℃保存备用。若长期保存，加入2?5倍容积乙醇，置-80℃保存。

    1?5?2引物的设计和合成采用ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成。引物和探针由中山大学达安基因诊断中心合成并纯化。序列如下：TGF?β1：Forward Primer:5’?CGGAATACAGGGCTTTCGATT?3’；Reverse Primer:5’?GCTGATCCCGTTGATTTCCA?3’；TaqMan Probe:5’?FAM?AGCGCTCACTGCTCTTGTGACA?TAMRA?3’。GAPDH（内参照基因）：Forward Primer:5’?TGTGTCCGTCGTG  GATCTGA?3’；Reverse Primer:5’?TGCCTGCTT CACCACCTTCT?3’；TaqMan Probe:5’?FAM?TGCCGCCTGGAGAAACCTG CC?TAMRA?3’。

    1?5?3逆转录反应取4μLRNA模板做逆转录反应，反应体系如下：5倍逆转录buffer4μL［逆转录buffer成分为50mmol/L Tris HCl(pH8?0)、50mmol/L KCl、4mmol/L MgCl2、10mmol/L二硫苏糖醇（DTT）］，上游引物（10pmol/μL）0?4μL，下游引物（10pmol/μL）0?4μL，dNTPs（10mmol/L）0?5μL，MMLV反转录酶（200U/μL）1μL，DEPC9?7μL，RNA模板4μL，总体积为20μL。反应条件：37℃、1h，然后95℃、3min。

    1?5?4荧光定量PCR反应以下反应均由PCR扩增仪扩增完成。反应体积为50μL，反应体系：5倍定量PCR buffer 10μL，上游引物F（10pmol/μL）1μL，下游引物R（10pmol/μL）1μL，dNTPs 0?5μL，荧光探针1μL，Taq 酶1?5μL，互补DNA（cDNA）5μL，重蒸水（ddH2O）30μL［PCR buffer成分为10mmol/L Tris?HCl(pH8?0)、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2］。反应条件：93℃、2min，93℃、45s， 55℃、45s，共40个循环。

    1?6免疫组化法检测各组小鼠肾组织TGF?β1含量采用免疫组化链霉亲和素—生物素过氧化物酶复合物（SABC）法。取免疫组化的肾组织切片，置于显微镜下，计数10个肾小球，光学放大400倍，图像经全自动图像分析系统处理，应用阳性单位（positive unit，PU）的计算公式计算阳性单位的数值，以各组的PU值进行比较。pPU=100%×(Ga-GA)/［(1-Aa)×Gmax］。注：Ga为阳性反应的平均灰度级；GA为整个视野的平均灰度；Aa为阳性反应的面积密度；Gmax为设定的灰度最高级（所用的是256），所有数据均由系统自动算出。

    1?7统计学方法采用SPSS 11?0统计软件进行统计分析。

    2结果

    2?1IgAN动物模型模型组小鼠尾静脉注射SEB后，死亡2只小鼠，其他小鼠均有不同程度的神态萎靡、皮毛蓬乱、反应性下降、食量减少等现象；而正常对照组小鼠活动度、反应性、进食量等均未见明显异常。模型组抽样测定小鼠24h尿蛋白定量为（11?72±4?42）mg/d，显著高于正常对照组的（5?54±1?46）mg/d（P ＜0?01）。光镜见模型组小鼠肾小球体积轻度增大，系膜细胞和基质中、重度增生，部分肾小球囊腔粘连，肾小球毛细血管管腔挤压变窄，而正常对照组小鼠肾小球未见明显异常（图1）；免疫荧光检查结果显示模型组小鼠系膜区IgA+++，而正常对照组小鼠系膜区IgA-～±（图2）。

    2?2肾组织TGF?β1含量的测定由表1可见，模型组小鼠肾组织TGF?β1含量显著高于正常对照组（P＜0?05）；益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGF?β1含量均显著低于模型组（P＜0?05）；益肾汤高、低剂量组小鼠之间肾组织TGF?β1含量无显著性差异（P＞0?05）。各组小鼠肾组织TGF?β1表达见图3：正常对照组有少量TGF?β1表达；模型组TGF?β1表达明显增强；益肾汤高、低剂量组TGF?β1表达减弱。表1各组小鼠肾组织TGF?β1 阳性表达单位值比较

    2?3TGF?β1 mRNA表达结果TGF?β1 mRNA标准扩增曲线见图4；TGF?β1 mRNA标准曲线直线回归见图5；各样本TGF?β1荧光扩增曲线见图6；各组肾组织TGF?β1 mRNA表达的差异见表2。表2结果显示模型组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA的表达显著高于正常对照组（P＜0?05）；益肾汤高、低剂量组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA的表达均显著低于模型组（P＜0?05）；两个益肾汤组小鼠之间肾组织TGF?β1 mRNA的表达无显著性差异（P＞0?05）。图5为小鼠TGF?β1荧光定量标准回归曲线图，横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为阈循环数nCt，相关系数r=0?998 6。线性关系良好，证实了nCt值进行定量的准确性。通过荧光定量PCR的扩增得知样本的nCt值，即可从该标准回归曲线上出该样本的起始拷贝数。 表2各组小鼠肾组织TGF?β1 mRNA定量表达比较

    3讨论

　　IgAN是目前公认的发病率最高的原发性肾小球疾病，其主要病理特点是：肾脏系膜细胞和系膜基质增生［3］。IgAN系膜细胞和基质增生是多种因素综合作用的结果，多种细胞因子的作用与IgAN的发生和进展有关［4］。TGF?β1作为一种多功能的细胞因子，通过细胞表面复杂的受体信号传导途径调控细胞的增殖、分化和凋亡［1］，特别在调控细胞外基质聚积(ECM)的过程中起中心调节作用，其主要机制有： (1)增加ECM的合成；(2)增加蛋白酶抑制因子的合成，减少ECM的降解；(3)增强细胞表面与ECM结合的受体—整合素的表达。近年来研究发现TGF?β1在IgAN的发生、中均有十分重要的作用，IgAN的血尿可能是因为链球菌感染后通过增加TGF?β1合成从而刺激IgA产生并最终导致IgAN的发生［5］；在IgAN的进展过程中肾内肾素血管紧张素系统（RAS）和通过TGF?β1介导的早期纤维化密切相关［6］。FQ?PCR原理［7］：利用Taq酶对荧光双标记探针的切口平移效应，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化，当信号增强到某一阈值时，此时的循环阈值（nCt值）就被记录下来，该参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系，利用阳性梯度标准品的nCt值制成标准曲线，再根据样品的nCt值就可以准确定出起始DNA的数量。中医学认为IgAN属本虚标实之证，以肺、脾、肾三脏虚弱为本，外感、水湿、湿热、瘀血及湿浊为标［8］。研究表明［9］，ECM聚积与中医的“血瘀”有密切的联系，益气、化瘀法是中医治疗肾小球疾病的常用治法，有确切的疗效。益肾汤是在古代名方六味地黄丸（《小儿药证直诀》）基础上，结合临床用药体会加减化裁而成。方中熟地甘柔补血、滋肾填精，当归补血活血；山茱萸、枸杞子、女贞子滋养肝肾固肾气，黄芪补气升阳，山药健脾益胃以助运化，茯苓渗利脾湿，牡丹皮凉泻肝火，生地、赤芍、白茅根清热凉血，金樱子固精，旱莲草滋阴，仙鹤草收敛。诸药合用，具有滋阴补肾固精、清热凉血活血之功效，主治肝肾阴虚之证。益肾汤组方中，多味中药均有益气、活血、化瘀之功效［10-11］，因此，益肾汤治疗IgAN符合中医学及医学对IgAN病因、病理、病机的认识。已有临床验证益肾汤具有减少IgAN患者的蛋白尿、稳定患者肾功能的作用［12］。本实验结果显示，IgAN模型小鼠肾组织TGF?β1的分泌及其mRNA表达显著升高，提示TGF?β1参与了IgAN的发病过程，对IgAN模型所见的ECM增加有重要意义；益肾汤治疗组小鼠肾组织中TGF?β1的分泌及其mRNA表达较IgAN模型组显著减少，显示益肾汤可抑制IgAN肾组织中TGF?β1的表达、减少ECM的合成，进而延缓IgAN肾小球硬化的进展。

【】
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