微米大黄炭治疗胃溃疡出血作用机制的实验研究

               作者：时昭红，张介眉，张书，冯云霞，侯光华

【摘要】  【目的】探讨微米大黄炭胃溃疡出血的止血作用机制。【方法】选用昆明种小鼠和SD大鼠为研究对象，随机分为空白对照组、云南白药组（剂量为9g·kg-1·d-1）和微米大黄炭高、中、低剂量组（剂量分别为8、4、2g·kg-1·d-1），灌胃给药6d后检测小鼠出、凝血时间及血小板计数；测定大鼠血小板功能及纤溶活性等指标。【结果】与空白对照组比较，微米大黄炭各剂量组均能缩短小鼠出、凝血时间（Ｐ＜０?０1），增加血小板计数（Ｐ＜０?０5或Ｐ＜０?０1），提高大鼠血小板聚集性，上调血栓烷素B2（TXB2）而下调6?酮?前列腺素F1α（6?keto?PGF1α）水平（Ｐ＜０?０５或Ｐ＜０?０1），升高血小板颗粒膜蛋白?140（GMP?140）含量（Ｐ＜０?０5或Ｐ＜０?０1）；缩短大鼠凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）（Ｐ＜０?０1），而对组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）和组织型纤溶酶原抑制剂（PAI?1）活性无显著影响（Ｐ＞０?０５）。【结论】通过激活内源性和外源性途径的多种凝血因子而促进凝血过程中的凝血酶原和凝血活酶的生成，增加血小板计数和聚集性可能是微米大黄炭止血的重要作用机制。

【关键词】  微米大黄炭/药；胃肠出血/中药疗法；疾病模型，动物；大鼠；小鼠

微米大黄炭为武汉市第一治疗消化性溃疡并出血的新型中药制剂，临床运用疗效确切［1］。本研究观察了该制剂对实验动物凝血时间、血液凝固系统、纤溶系统及血小板的影响，阐明其治疗胃溃疡出血的止血作用机制，现报道如下。

    1材料与方法

    1?1药物微米大黄炭由武汉市中西医结合医院制剂科制备（批号：200506）；云南白药由云南白药集团股份有限公司生产（批号：20051113）。

    1?2动物清洁级昆明种小鼠180只，体质量（20±2）g，雌雄各半，由同济医学院实验动物室提供，合格证号：SCXK（鄂）2004?0007；清洁级SD大鼠100只，体质量200~250g，雌雄各半，由同济医科大学动物中心提供，合格证号：SCXK（鄂）2004?0007。

    1?3试剂与仪器大鼠组织型纤溶酶原激活剂及其抑制剂（t?PA/PAI?1）试剂盒及血小板颗粒膜蛋白?140（GMP?140）试剂盒均由大连泛邦化工有限公司提供；125I?6?酮?前列腺素F1α（6?keto?PGF1α）放射免疫分析药盒、125I?血栓烷素B2（TXB2）放射免疫分析药盒均购自北京科美东雅生物技术有限公司（生产批号：20060725）；LBY?NJ2型血液凝聚仪（北京普利生公司产品）；MK3型Thermo酶标仪（上海热电仪器有限公司）；DFM?96型多管放射免疫计数器（合肥众成机电技术公司）。

    1?4指标检测

    1?4?1凝血时间和出血时间的测定取昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为微米大黄炭低、中、高剂量组（简称大黄炭低、中、高剂量组），云南白药组和空白对照组5组，每组12只，大黄炭低、中、高剂量组分别以2、4、8g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，云南白药组给予云南白药，剂量为9g·kg-1·d-1，空白对照组给予等容积生理盐水。连续给药6d，1次/d。于末次给药1h后，按毛细血管法［2］测定凝血时间，以断尾法［3］记录小鼠出血时间。

    1?4?2血小板计数的测定取昆明种小鼠60只，分组方法及给药方法同1?4?1，每组12只，于末次给药1h后摘取右侧眼球取血0?5mL，在全自动血小板计数仪上检测。

    1?4?3血小板凝集性测定取SD大鼠50只，雌雄各半，分组方法及给药方法同1?4?1，每组10只。于末次给药0?5h后，30mg/L戊巴比妥钠10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心脏穿刺取血1?8mL，按说明书要求分离富含血小板血浆（PRP）和血小板血浆（PPP），分别置于比色杯中，调整好透光度后，将诱导剂二磷酸腺苷（ADP）2μmol(1μmol/mL)加入PRP中，记录浊度改变曲线及最大聚集率（pMA/%）。

    1?4?4TXB2、6?keto?PGF1α及血小板GMP?140含量测定取清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，分组及给药方法同1?4?1，每组10只。末次给药后0?5h后，按0?02mL/kg剂量腹腔内注射20mg/L戊巴比妥钠麻醉，心脏穿刺取血2mL，用消炎痛乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）抗凝备检，以3 000r/min离心10min，分离血浆，严格按试剂盒说明书步骤操作，采用放射免疫法测定TXB2和6?keto?PGF1α含量，采用酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法测定GMP?140含量。

    1?4?5组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）及其抑制剂（PAI?1）水平测定取清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，分组及给药方法同1?4?1，每组10只。末次给药后1h，以30mg/L戊巴比妥钠10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心脏穿刺取血2mL，用EDTANa2抗凝备检，3 500r/min离心15min，分离血浆，采用ELISA法检测t?PA、PAI?1水平。

    1?4?6凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）测定取清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，分组及给药方法同1?4?1，每组10只。末次给药后1h,以30mg/L戊巴比妥钠10mL/kg腹腔注射麻醉，背位固定，心脏穿刺取血1?8mL，38mg/L枸椽酸钠（与血液容积比为1∶9）抗凝，以3 000r/min离心10min分离血浆后，在全自动血凝分析仪上检测PT和APTT值。

    1?5统计学方法采用SPSS 13?0统计软件进行统计分析。

   2结果

    2?1各组对小鼠出、凝血时间及血小板计数的影响表1结果显示，大黄炭高、中、低剂量组和云南白药组均能缩短小鼠出、凝血时间，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0?01）；与云南白药组比较，大黄炭高剂量组作用显著（P＜0?05）。各给药组均能显著提高小鼠血小板计数（P＜0?05），其中大黄炭高、中剂量组作用显著（P＜0?01）；与云南白药组比较，大黄炭高剂量组可显著提高小鼠血小板计数（P＜0?05）。

    2?2各组对大鼠血小板聚集性及TXB2、6?keto?PGF1α、GMP?140含量的影响表2结果显示，各给药组均能显著提高血小板最大聚集率及TXB2、GMP?140含量（P＜0?05或P＜0?01），显著降低6?keto?PGF1α含量（P＜0?05或P＜0?01），大黄炭低、中、高剂量作用呈现一定的剂量效应关系，且大黄炭高剂量组除GMP?140含量外，作用均优于云南白药组（P＜0?05）。

    2?3各组对大鼠PT、APTT和t?PA、PIA?1活性的影响表3结果显示，各给药组均可显著缩短大鼠PT、APTT（P＜0?01）,且大黄炭中、高剂量组缩短PT的作用优于云南白药组（P＜0?05），但大黄炭各剂量组对t?PA及PAI?1活性无显著影响（P＞0?05）。

    表1各组对小鼠出、凝血时间及血小板计数的影响表2各组对大鼠血小板凝集性及TXB2、6?keto?PGF1α、GMP?140含量的影响

    3讨论

　　大黄止血最早记载于汉代张仲景《伤寒论》，临床运用于各种血证，故有“血证要药”之称。《血证论》中亦云：“大黄一味，既是气药，又是血药，止血而不留瘀，尤为妙药。”大黄有效止血成分单体d?儿茶素和没食子酸为阐述大黄止血功能提供了物质依据［4］。根据中药“烧炭存性”的原理［5］，我们在采用超微粉碎技术与传统炮制技术相结合的基础上研制新型中药制剂，该药物采用超微粉碎仪将大黄炭粉碎过200目筛制成微米中药，使其在保持原有药性的基础上又最大限度地提高药物的吸收和生物利用度，同时缩短了药物的起效时间。凝血时间可反映内源性凝血途径凝血因子的活性，活化部分凝血活酶时间的测定亦是用于检测对内源性凝血途径的影响，涉及因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ等多种凝血因子的功能，而凝血酶原时间测定主要用于检测外源性途径的有关因子，因而可反映药物对外源性凝血途径的作用［6］。本文结果表明，微米大黄炭组的凝血时间、活化部分凝血活酶时间以及凝血酶原时间均显著缩短，说明其对内源性和外源性凝血途径的多种凝血因子具有可靠的激活作用而实现内促凝血。正常止血与凝血机制包括血管壁、血小板和凝血因子等多方面的作用，而血小板的黏附、聚集作用在止血初期具有重要意义［7］。TXA2是目前已发现的最强的缩血管物质与血小板聚集剂之一［8］。PGI2则是较强的血小板功能的抑制剂，具有抑制血小板的黏附、聚集和释放反应，抑制血小板的促凝活性等作用［9］。PGI2和TXA2之间的动态平衡是维持正常止血功能的基础，血小板与血管壁接触时被激活，合成和释放TXA2并促进血小板聚集，而血管壁利用自身或外源性的花生四烯酸合成PGI2。由于TXA2和PGI2的半衰期很短，一般将TXA2和PGI2稳定的代射产物TXB2和6?keto?PGF1α作为判断其浓度的指标［10］。而血浆GMP?140是目前所知较能反映血小板活化和释放反应的特异性标记物［11］。本研究结果表明，微米大黄炭能显著提高大鼠血小板聚集性，且高剂量组作用最为显著，效果优于云南白药。通过TXB2和6?keto?PGF1α含量的检测证实，微米大黄炭高剂量组能显著提高大鼠TXB2的含量同时下调6?keto?PGF1α的含量，且调节作用优于云南白药，说明微米大黄炭活化血小板的作用优于云南白药。而在对GMP?140的检测中亦证实了这一点。在纤溶系统中，产生于血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂（t?PA）及其抑制剂（PAI?1）发挥重要作用［12］。t?PA能选择性地激活纤溶酶原形成纤溶酶，继而催化纤维蛋白水解。PAI?1是t?PA活性主要的生理性抑制剂，PAI?1能快速与t?PA结合，形成1∶1复合物而使t?PA失活。t?PA与PAI?1在纤溶系统激活过程中起着相互拮抗的作用［13］。在对t?PA及PAI?1活性的检测中发现，微米大黄炭对大鼠t?PA及PAI?1活性无显著影响，提示微米大黄炭的止血作用与纤溶活性无关。因此我们初步认为，通过激活内源性和外源性途径的多种凝血因子而促进凝血过程中的凝血酶原和凝血活酶的生成，同时增加血小板计数和聚集性可能是微米大黄炭止血作用的重要作用机制。

【文献】
  ［1］时昭红，张书，胡伟，等.微米大黄炭胃镜下喷洒消化性溃疡出血的临床观察［J］.内科急危重症杂志,2007,13(3):134.

［2］Koo Y J,Taylor N H,Hely D Y,et al.Endometrial cell proliferation in the women following endometrial ablation［J］.Hum Reprod,1996,11(5):1067.

［3］Abberton K M,Tayior N H,Healy D L,et al.Vascular smooth muscle cell proliferation in arterioles of the human endometrium［J］.Hum Reprod,1999,14(4):1072.

［4］陈燕,赵辉,谢锐.大黄的药理及临床研究近况［J］.西南国防医药,2005,2(15),180.

［5］叶定江,张世臣.中药炮制学［M］.上海:上海技术出版社,1995:98.

［6］王鸿利.血栓与止血检验技术［M］.上海:上海科技出版社,1991:98.

［7］王振义.止血与血栓基础理论与临床［M］.第2版.上海:上海科学技术出版社,1996:104.

［8］庞爱明,阮长耿.绿茶的主要成分没食子儿茶素、没食子酸酯(EGCG)对血小板功能影响的研究［J］.血液流变学杂志,2004,14(1):37.

［9］刘耀武,马腾飞,蒋新颖,等.盐酸戊乙奎醚对高黏血症大鼠微循环和血液流变性的影响［J］.中国微循环,2006,10(6):415.

［10］杨月艳.老年上消化道出血患者PGI2及TXA2检测及其临床意义［J］.现代中西医结合杂志,2003,12(4):1483.

［11］黄智铭,韩清锡.肝硬化患者血浆GMP?140及VWF变化的初步探讨［J］.中国实用内科杂志,1999,19(1):35.

［12］张晓平,构春.TNF?α、t?PA/PAI?1在2型糖尿病血管并发症中的意义［J］.辽宁医学杂志,2006,20(1):13.

［13］韩纪举,魏然,陈彬,等.血液t?PA和PAI?1水平及活性与血液流变学指标的相关性分析［J］.中国血液流变学杂志,2004,14(2):160.