主成分分析对佛手最佳产地的探讨
作者：崔红花 高幼衡 蔡鸿飞 魏志雄 何巧君
【摘要】 [目的]分析不同产地佛手中生物活性成分分布，探索佛手最佳产地的优选方法，以确定最佳产地。[方法]采用三维高效液相色谱法，梯度洗脱，测定17批不同产地佛手中5种生物活性成分(柠檬油素、6?7?二甲氧基香豆素、橙皮苷、5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素、6?羟基?7?甲氧基香豆素)的含量，并对其进行主成分分析。[结果]所建模式合理，具有一定的可行性和可靠性，为探讨佛手最佳产地提供了一种新的方法。[结论]佛手最佳产地以广东肇庆为最佳。
【关键词】 佛手/化学 主成分分析 色谱法 高压液相
佛手为芸香科柑桔属植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果实，主产于我国广东、四川、浙江等地，其花、叶和果实均可入药，其味辛苦酸，性温，入肝、胃经，具有疏肝理气、和胃止痛的功效，用于肝胃气滞、胸胁胀痛、胃脘痞满、食少呕吐等症[1-3]。药理实验证明佛手提取物及有效成分具有祛痰、镇痛、抗菌抗炎、溶胆结石、抗蝮蛇毒素、利尿、局麻、抗癌等多种功效[3-6]，在我国已经有400多年的种植和应用。
佛手始载于《本草纲目》，我国的佛手药材种类较多，来源复杂，古代常与枸橼、香橼等相混淆，历来按产地可分为广佛手、川佛手、金佛手、建佛手、云佛手和兰佛手等，现行规格主要分为广佛手、川佛手及金佛手，何种最优，各有说法[7]。由于佛手在当前国内外市场的需求量日益增大，目前品种混乱、质量参差不齐，若无相应的标准控制，很可能大大影响临床效果。化学成分分析结果表明佛手是一种富含香豆素类化合物的植物，同时还含有黄酮类、柠檬苦素类等成分[8]。关于不同产地佛手多种生物活性成分含量分析的研究尚未见报道，只见关于橙皮苷单一成分的含量研究[9]。仅针对中药材的某个成分或指标成分分析最佳产地，难于真正反映其质量。本研究将香豆素及黄酮类化合物作为参照物，应用三维高效液相色谱(HPLC?DAD)法，采用SPSS统计软件进行主成分分析，对佛手的产地问题进行综合分析，为探讨最佳产地及其药材质量评价方法的建立提供新的模式，现报道如下。
1 材料
1.1 药物 收集17批不同产地佛手药材(主产地或商品，药材来源见表1)，经广州中医药大学程怡教授鉴定;对照品柠檬油素、6?7?二甲氧基香豆素、5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素、6?羟基?7?甲氧基香豆素均为作者从川佛手植物中提取分离得到，橙皮苷由生物药品制品检定所提供(将它们依次编号为化合物1～5)，经波谱分析鉴定结构，归一化法其质量分数为98%以上。
1.2 主要试剂与仪器 美国DIONEX SUMMIT P680高效液相色谱仪(四元梯度泵，CHROMELEONTM数据处理软件系统);甲醇、乙腈为色谱纯(美国Dikma公司，色谱用);水为自制超纯水;乙酸乙酯、甲醇、乙醇(广州化学试剂厂，提取用)均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 流动相及梯度洗脱条件的选择 化合物3～5结构中均含有酚羟基，化合物1、2中含有含氧基取代，因而它们在分析时很容易产生拖尾，使峰变宽，分离度下降，因此要选择偏酸性的流动相，这样才能减少色谱峰的拖尾，改善峰形,提高峰形的对称程度。在比较了甲醇-冰醋酸水系统和乙腈-冰醋酸水洗脱系统色谱分离效果后，最终选择乙腈-冰醋酸水洗脱系统，并通过多次对比试验确定了最佳的梯度洗脱系统。在乙腈-冰醋酸水梯度洗脱系统中，样品中化合物1～5能得到基线分离，而且色谱的对称性都很好。表1 佛手药材的来源
样品号样品来源产地采收期规格购买日期F1吉林省片2005.05.04F2天津市丝2005.04.29F3昆明市云南片2005.04.25F4浙江金华市尖峰大药房连锁有限公司淅江金华(广东苗)片2005.04.18F5秦皇岛市唐人医药商场广西2004.03.10片2005.05.08F6秦皇岛市唐人医药商场广东2004.07.05片2005.05.08F7河北祺新中药颗粒饮片有限公司广东2004.7～8片2005.03.20F8河北祺新中药颗粒饮片有限公司广西片2005.03.20F9河北祺新中药颗粒饮片有限公司河北2004.7～8片2005.03.20F10四川乐山市中药材市场四川洪雅2004.7～8片2005.04.20F11四川乐山市中药材市场四川沐川2004.7～8片2005.04.20F12四川成都市荷花池市场四川沪县片2005.04.26F13四川成都市荷花池市场四川合江片2005.04.26F14黑龙江三棵针药材市场广东片2005.03.15F15黑龙江三棵针药材市场广西片2005.03.15F16广州清平药材市场广东肇庆片2005.05.08F17广州清平药材市场广东德庆片2005.05.17
2.2 检测波长的选择 化合物1、2、4、5均为简单香豆素类化合物，其中化合物1、4于217nm及315～330nm(loge4.2)处可见2个强吸收峰，同时在250～270nm(loge3.8～3.9)处有1个弱吸收峰(见图1)。但化合物2、5为6，7?二氧代香豆素，它们有230nm、340～350nm2个强吸收峰，同时有260nm、300nm2个相等强度的次强峰，它们表现出了类似的紫外吸收曲线，在230nm附近有1个最大吸收峰。化合物1和2在210nm附近有最大吸收，但因为是末端吸收，故吸收波长分别确定为327nm、230nm。化合物3为二氢黄酮苷，所以呈现出典型二氢黄酮类化合物的2个吸收带(带Ⅰ和带Ⅱ)，即具有强的带Ⅱ吸收(270～295nm)，而带Ⅰ以肩峰或低强度吸收峰出现。结果见图1。
2.3 色谱条件 Kromasil C18分析柱(250mm×4.0mm，5μm);流动相为A(乙腈)?5g/L冰醋酸水溶液。线性梯度洗脱时间程序：0～3min，A的比例为5%;3～8min，A的比例由5%升高到10%;8～48min，A的比例由10%升高到27%;48～63min，A的比例由27%升高到55%;63～68min，A的比例由55%升高到100%;68～75min，A的比例为100%。体积流量：1mL/min;检测波长：柠檬油素为327nm，6，7?二甲氧基香豆素为230nm，橙皮苷为290nm，5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素为212nm，6?羟基?7?甲氧基香豆素为229nm;柱温30℃;分析时间为75min。对照品和样品的色谱图见图2。
2.4 样品溶液的制备
2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取柠檬油素、6，7?二甲氧基香豆素、橙皮苷、5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素、6?羟基?7?甲氧基香豆素对照品适量，溶于甲醇配制成浓度依次为2.04、0.60、0.64、0.62、0.30mg/mL的对照品溶液，备用。
2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取佛手药材粉末(过80目筛)1.5g于索氏提取器中，加体积分数75%乙醇70mL，提取4h，滤过，蒸干，残渣以甲醇溶解并定容至10mL，微孔滤膜滤过，备用。
2.5 线性关系的考察
分别精密吸取标准溶液，注入高效液相色谱仪，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2。
2.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，连续进样5次，测定5个对照色谱峰的峰面积，并计算其sR值，测得sR在0.47%～2.69%范围内。
2.7 重现性试验 取同一批号供试品5份，按2.4.2表2 样品线性关系项下方法制备供试品溶液，以2.3项下色谱条件测定各色谱峰峰面积的sR值，测得sR在1.21%～4.47%范围内。
2.8 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、6、10h进样，结果测得各色谱峰峰面积的sR范围在0.36%～3.17%。
2.9 加样回收率试验 精密称取已知柠檬油素、6，7?二甲氧基香豆素、橙皮苷、5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素、6?羟基?7?甲氧基香豆素含量的供试品粉末(80目)，定量加入柠檬油素、6，7?二甲氧基香豆素、橙皮苷、5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素、6?羟基?7?甲氧基香豆素对照品适量，按2.4.2项下方法进行制备操作，测定各化合物的加样回收率，测得加样回收率范围为95.47%～103.69%。
2.10 含量测定 精密吸取样品溶液20μL连续进样2次，测定峰面积，化合物1～5的含量，测定结果见表3。表3 佛手样品中化学成分含量测定结果
2.11 主成分分析
在数据分析工作中，常常需要将很复杂的数据集简化，即将P个指标所构成的P维系统简化为一维系统。主成分分析能设法将原来众多具有一定相关性的指标(比如P个指标)，重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来的指标。若从主成分的观点来讨论这个问题，主成分分析所构成的第一主分量正是这一问题的答案，它提供了自身的权重系数。
主成分分析(principal component analysis)是一种将多个变量通过线性变换以选出较少个重要变量的多元统计分析方法，又称主分量分析。在实际课题中，为了全面分析问题，往往提出很多与此有关的变量(或因素)，因为每个变量都在不同程度上反映这个课题的某些信息。但是，在用统计分析方法研究这个多变量的课题时，变量个数太多就会增加课题的复杂性。人们希望变量个数较少而得到的信息较多。在很多情形，变量之间是有一定的相关关系的，当两个变量之间有一定相关关系时，可以解释为这两个变量反映此课题的信息有一定的重叠。当变量较多时，在高维空间中研究样本的分布就更复杂。主成分分析采取一种降维的方法，找出几个综合因子来代表原来众多的变量，使这些综合因子尽可能地反映原来变量的信息量，而且彼此之间互不相关，从而达到简化的目的[10～12]。
本研究对不同产地佛手中5种生物活性成分进行含量测定，并采用SPSS统计软件进行主成分分析，其结果见表4～6、图3、4。表4 特征值(λ)表 由表4和图3得知，从特征值的大小来看，λ1=1.856，λ2=1.341，λ3=1.135，而其他远小于1;从贡献率来看，λ1的贡献率最大为37.111%，而λ2、λ3的贡献率相差不大，约为20%多，其他的贡献率较小;从累积贡献率来看，取前3个特征值时，累积贡献率为86.629%，大于80%，故取前3个为主成分(因子)。由表5可以看出，第1主成分(因子1)主要反映了来自原始指标化合物1(柠檬油素)和化合物4(5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素)的信息，第2主成分(因子2)主要反映了来自原始指标化合物3(橙皮苷)和化合物5(6?羟基?7?甲氧基香豆素)的信息，第3主成分(因子3)主要反映了来自原始指标化合物2(6，7?二甲氧基香豆素)的信息。表5 公共因子载荷矩阵表对佛手进行主成分分析，发现λ1对确定最佳产地贡献度最大，达到37.111%，是主要因子。从表6可看出，F16最佳，包含了5种主要化学成分的最佳综合信息。
综上所述，根据各个主成分的得分进行综合分析评价，可以把F16(广东肇庆)确定为最佳产地样品，这样就为多指标确定最佳产地提供了新的模式。表6 公共因子得分表注：Y(i，1)代表样品的主成分得分，i代表原始指标测定值的个数，1代表因子1。如果Y(i，1)数值大，就说明i产地的因子1所体现的原始指标的含量就高，反之则低。
3 讨论
3.1 样品中化合物1～5色谱峰的确定 从图2可以看出样品的色谱峰数目比较多，加上测定的化合物数量较多而且有的相隔很近，如化合物2和3的色谱峰及化合物1和4的色谱峰，因此，除采用保留时间对比和加入对照品观察强度变化这些常用的方法外，还进一步通过对比标准品和样品相应色谱峰的紫外吸收曲线来进一步确定了化合物1～5所对应的色谱峰。我们分别对比了对照品和样品中化合物1～5的紫外吸收曲线(见图1)，可以发现对照品中各化合物分别与样品中相对应色谱峰有相同的紫外吸收曲线，据此就可以更加准确地判断最终确定的色谱峰是要检测的化合物。图1 化合物1～5的紫外吸收曲线
3.2 含量直观分析 本研究采用HPLC法建立了同时测定佛手药材中4种香豆素类化合物和1种黄酮类化合物含量的方法，该法简便、快速、准确，可用于大批量佛手药材的质量评定。
通过对佛手中多种成分进行含量分析，不仅了解了相关化学成分在不同产地佛手药材中的含量或分布，还可以借此去控制和评价药材的质量。本含量分析实验中，在保证佛手中待测成分分离度的情况下，通过调整梯度洗脱条件，使其他色谱峰也得到了较好的分离。从图2所示的样品色谱图可以看出，在文中的色谱条件下，绝大部分色谱峰都得到了基线分离。这为今后佛手指纹图谱的建立打下了很好的基础。
本实验中，分别对不同产地佛手进行了含量测定，结果表明，所测的5个化合物在样品中的含量有较大的差异。从表3所示的含量测定结果可以直观地看出，佛手中柠檬油素含量高于其他成分，且6，7?二甲氧基香豆素只在F12样品中测得，在其他样品中均未测得。佛手中5?羟基?7?甲氧基?8?异戊烯基香豆素含量低，在F11和F17样品中未测得。6?羟基?7?甲氧基香豆素含量极低，在多个样品中均未测得。图2所示的样品色谱图也显示了上述特点，从该图中还可以看出62min左右色谱峰(柠檬油素峰)明显高于其他成分色谱峰。以上分析表明，本实验条件下建立的色谱图，能够反映不同产地的药材在品质上的差别。
3.3 主成分分析 本文对不同产地佛手进行主成分分析后发现，λ1对确定最佳产地贡献度最大，达到37.111%，是主要因子，根据各个主成分的得分进行综合分析评价，广东肇庆产佛手最佳，包含了5种主要化学成分的最佳综合信息。
中药材有效成分含量的高低，即中药材的内在品质，直接影响着中药材、中成药和中药饮片的质量和临床疗效。以往在中药材的生产和产地加工过程中，往往只注重中药材的产量、生产效益和药材的外形质量，而对药材有效成分的积累动态和药材的内在品质却很少重视。药材质量包括内在质量和外观性状，所以中药材最佳产地应是能提供有效成分含量最高，外观性状如形、色、质地、大小等最佳的药材产地。
佛手中生物活性成分的形成和积累同样与生物环境有关。仅以佛手中的单一成分判断佛手的优劣是不全面的。柠檬油素在佛手药材中含量较高，而且药理实验证明柠檬油素为佛手药材的主要有效成分之一[13-14]，所以将柠檬油素与其他成分作为佛手药材质量评价的指标，研究和探讨影响佛手药材品质的各种因素，对提高和稳定佛手药材质量具有重要意义。因此，中药材的最佳产地应考虑其生物活性成分含量，再结合其产率及功效进行综合分析，以生物活性成分绝对最大含量或最大生物效价为基本原则，确定最佳产地，以保证药物能发挥最大的疗效。
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