中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究

                      作者：蔡望喜， 尹杉杉， 常建方

【摘要】  　　[目的] 观察益气化纤汤对肺纤维化模型大鼠肺泡巨噬细胞(AM)和肺间质巨噬细胞(IM)中转化生长因子β1(TGF?β1)mRNA表达的影响。[方法]选用Wistar大鼠96只，随机分为假手术组、模型组、益气化纤汤组(剂量为4g·kg-1·d-1)、氢化可的松组(剂量为20mg·kg-1·d-1);采用博莱霉素A5(剂量为6mg/kg)气管注入法复制肺纤维化模型;分别于造模第7、28天分离培养AM、IM，采用分子原位杂交法(ISH)检测TGF?β1mRNA的表达。[结果]模型组AM、IM中TGF?β1mRNA表达阳性细胞百分率及积分光密度(D)值显著升高(均P<0.01);益气化纤汤可显著降低AM、IM中TGF?β1mRNA表达阳性细胞百分率及D值(均P<0.01),其作用与氢化可的松相仿。[结论]益气化纤汤肺纤维化的作用可能与其能降低TGF?β1的表达，抑制纤维化的进程有关。

【关键词】  益气化纤汤/药 肺纤维化/中药疗法 转化生长因子β 肺泡巨噬细胞/病理学 肺间质巨噬细胞/病理学 疾病模型 动物 大鼠

　　肺纤维化进程中转化生长因子β1(TGF?β1)的作用极为关键 。TGF?β1是致纤维化关键性的细胞因子，它可以通过自分泌、旁分泌等不同的方式，调节细胞增殖、分化、移行，促进成纤维细胞对胶原蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的合成和沉积，从而导致脏器纤维化的形成[1]。益气化纤汤为我院治疗特发性肺纤维化的验方。本实验依据病理进程，分别收集实验第 7 天肺泡巨噬细胞(AM)、第 28 天肺间质巨噬细胞(IM)标本，采用分子原位杂交法(ISH)观察不同时间点巨噬细胞中TGF?β1 mRNA的表达情况，探讨益气化纤汤治疗肺纤维化的作用机制，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性SPF级Wistar 大鼠，体质量170～210g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号为SCXK(鄂)2005?0005。

　　1.2 主要试剂与仪器 益气化纤汤(0.4g/mL)由湖北省中药剂科提供，批号：20060101;注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生化制药厂生产，批号：20060204;博莱霉素A5为天津太河制药有限公司产品，批号：050601;TGF?β1原位杂交试剂盒购自武汉Boster公司，批号：060405;寡核苷酸探针序列：5??ACCTGCAAGACTATCCACATGGAGCTGGTG?3?，5??TGTACAACAGCACCCGCGACCGGGTGGCCG?3?，5??GTACCAGAAATACAGCAACAATTCCTGGCG?3?;Ficoll细胞分离液为美国GE公司产品，批号：289124;胶原酶Ⅰ为美国Invitrogen 公司产品，批号：124224l;DNA酶由华美生物技术有限公司提供，批号：2213123L。

　　1.3 动物造模[2]、分组及给药 大鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于操作台上,颈部正中线切口，钝性分离暴露气管，8号头皮针从气管软骨环间隙刺入气管，将博莱霉素A5 (6mg/kg)注入并使药物均匀分布在肺内，缝合肌肉、皮肤。假手术组除注入气管的为生理盐水(NS)外，其他同手术造模法。将96只大鼠随机分为4组，假手术组、模型组、益气化纤汤组和氢化可的松组，每组24只。假手术组及模型组均灌胃给予生理盐水10mL·kg-1·d-1;益气化纤汤组灌胃给药益气化纤汤4g·kg-1·d-1; 氢化可的松组皮下注射氢化可的松20mg·kg-1·d-1，依据病理进程，各组大鼠分别于第7、28天各处死9只。

　　1.4 肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞分离培养[3-4] 肺泡巨噬细胞分离收集：第7天处死动物，收集肺泡灌洗液3mL离心(4℃、2500r/min×10min )，弃上清，用NS洗涤细胞3次(4℃、2500r/min×10min) 。将沉淀与0.5mL NS混匀，取100μL做细胞涂片(玻片用多聚赖氨酸处理)，用1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗4 次，吹干，-20℃ 保存。

　　肺间质巨噬细胞分离培养：无菌新生牛血清(FCS)于56℃水浴30 min灭活补体，加入Ⅰ型胶原酶、DNA酶配成含体积分数10% FCS的RPMI?1640消化液，其中Ⅰ 型胶原酶浓度为200U/mL，DNA酶浓度为0.02mg/L ，抽滤灭菌，4℃ 保存。第28天处死大鼠，常规消毒，在超净工作台内，取右肺于无菌培养皿中。用D?Hank?s 液洗净，剪碎肺组织，玻璃匀浆器研磨，离心(4℃、2500r/min×15min)，弃上清，加入消化液消化(37℃、体积分数5%CO2)2～3h后取出，离心(4℃、2500r/min×10min )，D?Hank?s 液反复吹打后过100 目筛网(使之成为单细胞)，离心(4℃、2500r/min×15min )，弃上清。在试管中加入适量Ficoll分离液，将沉淀与D?Hank?s 液充分混匀，将混悬液缓慢滴加于分离液面上，水平离心(4℃、2500r/min×20min )。离心后管内分为3层，上层为血浆和D?Hank?s液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，主要为淋巴细胞和单核细胞(包括巨噬细胞)，用毛细管吸取单个核细胞，置入另一试管中，加入5倍以上体积的D?Hank?s液，离心(4℃、2500r/min×10min )， 洗涤细胞2次，将灭菌盖玻片置于6 孔板内，滴加分离的细胞，加入适量RPMI?1640培养液，37℃、体积分数5%CO2培养2～3h，在倒置显微镜下观察细胞贴壁后取出，生理盐水冲洗2 次，在玻片上用DEPC 处理的多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗4 次，吹干，-20℃保存。分子原位杂交(ISH)按试剂盒说明书进行。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 阳性细胞百分率 光镜下观察，胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，每一玻片随机取5个视野，阳性巨噬细胞数，再根据5个视野中总巨噬细胞数算出该片平均阳性细胞比例。

　　1.5.2 积分光密度(D) 样本玻片置于高清晰度彩色病理图文报告分析系统(HMIAS?2000)配套的Olympus显微镜下，CCD系统摄取细胞图像(40×10)，作尺寸及光密度定标。每例标本随机选取100个分散、无重叠的目标细胞，采用不同彩色分刻法获得图形，由系统计算出该切片TGF?β1 mRNA阳性面积的D值。

　　1.6 统计学方法 计量资料用F检验，计数资料采用Wilcoxon 秩和检验，组间比较采用多因素方差分析。

　　2 结果

　　大鼠模型组AM、IM中TGF?β1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值与假手术组比较显著升高(均P<0.01)，提示博莱霉素能造成大鼠TGF?β1 mRNA表达增高;氢化可的松组AM、IM中TGF?β1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值与模型组比较差异均有显著性意义(P<0.05或P<0.01);益气化纤汤组与模型组比较，AM、IM中TGF?β1 mRNA表达阳性细胞百分率及D值显著下降(均P<0.01)，提示益气化纤汤组与氢化可的松组有同样的生物学特性，能干预博莱霉素造成的TGF?β1 mRNA表达增高。结果见表1、表2，图1、图2(彩图见第316页)。表1 各组AM、IM中TGF?β1mRNA表达阳性① P<0.01，与假手术组比较;②P<0.05，③P<0.01,与模型组比较3 讨论对于肺纤维化的发病机理，近年来细胞因子学说[5]备受重视，各种致病因素引起肺泡上皮和(或)毛细血管内皮细胞损伤,外周血中免疫细胞聚集到肺部，肺常驻细胞(主要是巨噬细胞)细胞因子的基因表达均增强,分泌大量细胞因子，活化后与靶细胞特异受体结合，致使成纤维细胞、成肌纤维细胞在病灶部位增殖，肺泡上皮细胞非正常增生，最终导致肺泡与肺间质纤维化。

　　肺泡巨噬细胞在肺纤维化时，不仅其数量和活性增加，细胞表面抗原的表达也增加。作为在纤维化早期阶段升高的主要细胞类型之一，它在最初损伤及伴随组织损伤后的炎症反应中起关键性的作用。它能合成和释放大量具有多种生物活性的细胞因子(如TGF?β1)，在肺纤维化发生、过程中发挥重要作用，并产生和自分泌大量介质，对其他炎症和非炎症细胞起化学趋化剂和生长因子作用[6]。

　　肺间质巨噬细胞位于肺间质内，其产生的生物活性物质可直接作用于其他间质细胞及细胞外基质而影响肺间质的代谢。有研究表明[7]，IM的活化及其产生的生物学特性，对肺纤维化的形成更有意义。

　　TGF?β1作为最重要的促纤维化细胞因子，是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，能作用于多个环节，刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积，产生细胞外基质(ECM)蛋白如胶原、糖蛋白、纤维结合蛋白(FN);是一种强大的细胞增殖调节剂,对成纤维细胞有增殖效应，能够诱导特征性成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换，而肌成纤维细胞是胶原产生的主要位点;可抑制蛋白水解酶的产生，使细胞外基质沉积进一步增加[8]。

　　肺内许多细胞能分泌TGF?β1 ，如肺泡巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等，其中巨噬细胞被认为是分泌TGF?β1的主要细胞[9]。因此，研究肺纤维化AM，特别是IM中TGF?β1的变化，对揭示肺纤维化的发病机理具有特别重要的意义。本实验结果显示，博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠，其肺泡炎症期AM、肺纤维化期IM中TGF?β1mRNA表达与假手术组比较均显著性增高(P<0.01)，提示这些变化可能是肺纤维化演变发展的重要原因。

　　中医学认为，"肺虚络痹"是肺纤维化的基本病机。若肺气亏虚，络中血气运行无力，而血气瘀滞于肺络之中则形成肺虚络阻之证。治当益肺补气，活血通络。叶天士在《临证指南医案》 指出："大凡络虚，通补最宜"，其所谓补是补益络中之血气，通是化其痰瘀以疏通络道[10]。

　　益气化纤汤由黄芪、虎杖、水蛭等组成。方中黄芪为君，味甘，性微温，功能补气升阳，托毒生肌;虎杖味苦性平，有祛风、利湿、破瘀、通络等功效;水蛭味咸性寒入血，且破瘀通络而不伤正气，二药为臣，共佐黄芪奏益气活血、化瘀通络之效。以上诸药并用,可从整体上对肺纤维化形成的诸多环节进行综合性干预，减弱或阻断肺内持续进展的炎性细胞聚集，减少多种细胞因子尤其是致纤维化关键性细胞因子TGF?β1 合成与分泌，调整致纤维化细胞因子与抗纤维化细胞因子之间的平衡，减弱或阻断肺损伤后的异常修复过程，延缓或阻断肺纤维化的发生与发展。本研究结果表明益气化纤汤可减少AM，特别是IM中TGF?β1的表达，减弱细胞因子网络对于肺纤维化形成的促进作用,抑制纤维化的发展进程。

【】
  　　[1]Sempowshi G D,Bechmarr M P,Derdark S,et al.Subsets of murine lung fibroblasts express membrane? bound and soluble IL?4 receptors:role of IL?4 in enhancing fibroblast proliferation and collagen synthesis[J].J Immunol,1994,152:3603.

　　[2]Forgione M A,Cap A,Liao R,et al.Heterozygous cellular glutathione peroxidase deficiency in the mouse:abnormalities in vascular and cardiac function and structure[J].Circulation，2002，106(9):1154.

　　[3]Antoniades H N，Brovo M A，Avila R E，et al.Platelet?derived growth factor in idiopathic pulmonary fibrosis[J].J Clin Invest,1990,86: 1055

　　[4]Lavnikova N ，Prodhorova S，Helyar L ，et al.Isolation and partial characterization of subpopulations of alveolar macrophages，granulocytes，and highly enriched interstitial macrophages from rat lung[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1993,8:384.

　　[5]Coker R K,Laurent G J.Anticytokine approaches in pulmonary fibrosis: bringing factors into focus[J].Thorax,1997,52:294.

　　[6]高春芳,陆论根.纤维化疾病的基础和临床[M].上海：上海技术出版社,2004：439

　　[7]吕长俊.肺巨噬细胞亚群：肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞[J].国外医学:呼吸系统分册,1995,15(4):193.

　　[8]Bartram U，Speer C P.The role of transforming growth factor beta in lung development and disease[J].Chest,2004，125(3): 754.

　　[9]Khalil N，Berezay O,Sporn M,et al.Macrophage production of transforming growth factor β1 and collagen synthesis in chronic pulmonary inflammation[J].J Exp Med,1989,170:723.

　　[10]王海彤,武维屏.中医药弥漫性肺间质纤维化信息讨论[J].中医药信息杂志,1996,3 (7)：25.