优选中药淫羊藿总黄酮含量测定方法
作者：陈永刚 刘晓涵 林励 区计明 肖凤霞 罗穗红
【摘要】 [目的]比较不同测定方法对中药淫羊藿总黄酮含量测定的影响。[方法]分别采用《药典》(2005版)方法(药典法)和《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中2种方法(检验一法和检验二法)测定。 [结果]3批淫羊藿药材中，药典法所测总黄酮含量均值为27.21g/kg，检验一法所测总黄酮含量均值为9.22g/kg，检验二法测得的总黄酮含量均值为8.21g/kg。[结论]采用保健食品检验二法测定淫羊藿总黄酮含量更为简便、合理，可考虑作为淫羊藿中黄酮类物质含量测定的首选方法。
【关键词】 淫羊藿/化学 总黄酮/分析 分光光度法 紫外线
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)、箭叶淫羊藿〔Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc)Maxim.〕、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanense T.S.Ying)、或朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)的干燥地上部分。《本草纲目》称其有"益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力"之功效。各种淫羊藿均以淫羊藿苷、淫羊藿次苷及淫羊藿新苷等黄酮类成分为主[1]。药理实验研究表明[2],淫羊藿总黄酮能增加心脑血管血流量，促进造血功能、免疫功能及骨代谢，具有抗衰老、抗肿瘤等功效。
关于总黄酮的测定方法报道较多[3-4]，目前收载入相关国家标准的有3种方法：国家食品药品监督管理局颁布的"保健食品检验与评价技术规范实施手册"收载的2种方法[5](简称"检验一法" 和"检验二法");2005版《中国药典》收录的方法(简称"药典法")[6]。但关于此3法的准确性、合理性比较研究尚未见报道。本试验以淫羊藿为研究对象，以其总黄酮含量为评价指标，比较了上述3种方法对其含量测定的影响，为淫羊藿中总黄酮最佳测定方法的优选提供依据。现报道如下。
1 材料
1.1 仪器 8453E型紫外可见分光光度计(美国 Agilent);BP211D分析天平(德国Sartorius);KQ?500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 药材与试剂 淫羊藿药材(样品1批号为080602，样品2批号为080626，样品3批号为080731)购自广州致信药业有限公司，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定，其原植物为小檗碱科植物淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim.)的干燥地上部分;淫羊藿苷对照品(批号：110737?200414)、芦丁对照品(批号：100080?200306)均购自中国药品生物制品检定所;聚酰胺粉(柱层析用，60?80目)由浙江台州市路桥四甲生化塑料厂生产;水为双蒸水，甲醇、乙醇、苯、硝酸铝等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 药典法测定淫羊藿中总黄酮含量
2.1.1 淫羊藿苷对照品溶液的制备 取淫羊藿苷对照品，精密称定，加甲醇制成0.1mg/mL的溶液作为储备液，备用。
2.1.2 样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)约0.2g，精密称取，按[6]方法制备供试品溶液，备用。
2.1.3 标准曲线的绘制 取"2.1.1"项下储备液，置10mL量瓶中，加甲醇分别配制成浓度为0.0055、0.0073、0.011、0.0165、0.022mg/mL的溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y=52.407X-0.0652(r=0.9996，线性范围0.0055～0.022mg/mL)。
2.1.4 精密度试验 取淫羊藿对照品溶液(0.0165mg/mL)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为0.7939，sR为0.02%，表明精密度良好。
2.1.5 重复性试验 精密称取同一供试品0.2g，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量的均值为25.32g/kg，sR为 0.25%，表明该方法的重复性较好。
2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30、45、60min测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.1328，sR为0.36%，说明供试品溶液在60min内是稳定的。
2.1.7 加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号：080731，含量27.18g/kg)，加入淫羊藿苷进行试验，结果其平均回收率为101.01%，sR为3.17%，结果见表1。表1 加样回收率试验(药典法)
2.1.8 总黄酮测定 分别取供试品溶液和对照品溶液，以甲醇为空白，采用紫外可见分光光度法，在270nm波长处测定吸光度，，结果3批药材中总黄酮含量均值为27.21g/kg。结果见表4。
2.2 检验一法测定淫羊藿中总黄酮含量
2.2.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒质量的芦丁标准品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100mL，配成0.15mg/mL的芦丁标准溶液。
2.2.2 样品溶液的制备 取本品叶片粉末(过3号筛)1.0g，加入80mL体积分数70%乙醇溶液，按文献[5]方法制备供试品溶液，备用。
2.2.3 标准曲线的绘制 分别精密量取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL,相当于芦丁0、75、150、300、450、600μg,移入10mL刻度比色管中，加入体积分数30%乙醇液至5mL，各加50g/L的亚硝酸钠溶液0.3mL,振摇后放置5min,加入100g/L的硝酸铝溶液0.3mL摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2mL,用体积分数30%乙醇定容至刻度，以零管为空白，在510nm处测定吸光度，以对照品溶液中芦丁的量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为Y=1.136X+0.0106(r=0.9991，线性范围0.0782～0.6256mg)。
2.2.4 精密度试验 取对照品溶液(0.03128mg/mL)，连续测定5次，结果其吸收度的均值为0.3705，sR为0.11%，表明精密度良好。
2.2.5 重复性试验 精密称取同一供试品1.0g，平行5份，按上述方法测定其含量，结果其含量均值为9.722g/kg，sR为0.25%，表明该方法的重复性较好。
2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、15、30min测定其吸收度，结果其吸光度均值为0.6766，sR为0.50%，说明供试品溶液在30min内稳定。
2.2.7 加样回收率试验 精密称取已测含量的淫羊藿药材(批号:080731，含量9.742g/kg)，加入芦丁进行试验，结果其平均回收率为100.95%，sR为4.17%，结果见表2。表2 加样回收率试验(检验一法)
