足叶乙苷长循环脂质体的制备及血浆中稳定性研究

                       作者：时军 程怡 陈伟鸿 宿央央

【摘要】  　　[目的]研究足叶乙苷长循环脂质体的制备方法并考察其在大鼠血浆中的稳定性。[方法]采用乙醇注入法制备足叶乙苷长循环脂质体，用聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(PEG2000?DSPE)修饰脂质体膜，反相高效液相色谱(HPLC)法测定脂质体浓度，动态透析法考察其在大鼠血浆中的稳定性。[结果]足叶乙苷长循环脂质体的平均粒径为(180±26)nm，含量为(4.78±0.22)mg/mL，药物包封率为(88.71±8.2)%。在大鼠血浆中，普通脂质体和长循环脂质体24h累积释药率分别为(80.14±1.59)%和(46.72±2.61)%。[结论]乙醇注入法可制得包封率高、粒径小的足叶乙苷脂质体，PEG2000?DSPE修饰脂质体膜可增加脂质体的稳定性。

【关键词】  足叶乙苷/生产和制备 长循环脂质体/方法 色谱法 高压液相

　　足叶乙苷(etoposide) 为鬼臼毒素(podophyllotoxion)的半合成衍生物，临床上多用于小细胞肺癌、恶性淋巴瘤、恶性生殖细胞瘤、白血病等[1-2]，但有较严重的骨髓抑制和消化道反应。足叶乙苷难溶于水及许多药用溶剂，剂型有待于改进[3]。脂质体由于与机体有良好的生理相容性，是目前降低药物毒副作用、提高生物利用度的理想药物载体，但以传统的卵磷脂、胆固醇制备的常规脂质体进入循环系统后，在血液循环中滞留时间较短[4]。近年来研究表明[5]，将脂质体表面进行亲水改性，实现聚乙二醇化，将大大提高脂质体在血液循环中的稳定性，减少血浆调理蛋白的结合或破坏。本课题以聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(PEG2000?DSPE)修饰脂质体膜，制备足叶乙苷长循环脂质体，并初步考察脂质体双层膜的稳定性。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品与试剂

　　足叶乙苷(北京双鹤药业，批号：2007081105);注射用蛋黄卵磷脂(德国Lipoid公司);聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺(德国Lipoid公司);胆固醇(医药公司北京采购供应站);十八胺(Sigma公司);Sephadex G?50(瑞典Pharmacia公司);甲醇、乙腈为色谱纯，其他药品、试剂均为国产分析纯。

　　1.2 仪器

　　Zetasizer 激光粒度测定仪(英国Malvern公司);UV?1601紫外分光光度计(日本岛津);Dinonex高效液相色谱仪(P680型泵，PDA?100型检测器，ASI?100自动进样器，美国戴安公司);JY92?Ⅱ超声细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所);H?600透射显微镜(日本Hitachi公司);90?1型恒温磁力搅拌器(上海沪西分析仪器厂)。

　　1.3 足叶乙苷脂质体的制备

　　采用乙醇注入法制备足叶乙苷脂质体[6]。将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂乙醇胺按摩尔比10：5：0.3精密称定，溶于足叶乙苷热乙醇液中，保温(55±2)℃，在搅拌下匀速注入乙醇液至pH7.410mL磷酸盐缓冲液(PBS,0.05mol/L)中，注入过程中通入N2除去乙醇。注入完毕后，45℃孵育20min，探头式超声3min，再依次过0.8和0.45μm的微孔滤膜，即得足叶乙苷长循环脂质体(LCL)。同法制备普通脂质体(CL)，不同的是载体材料为卵磷脂、胆固醇、十八胺(摩尔比10：5：1.6)。

　　1.4 脂质体的形态、粒径大小和表面电荷的测定

　　取样品适量，稀释，滴加磷钨酸染色液，混匀，用铜网蘸取混合液，干燥，于透射电镜下观察并照相。用激光粒径测量仪测定样品的平均粒径、Zeta表面电位。

　　1.5 脂质体中足叶乙苷含量的测定

　　1.5.1 紫外光谱扫描 将药物、含药脂质体和空白脂质体分别用Triton X?100乙醇混合液溶解稀释后，于190～700nm处扫描，药物和含药脂质体在285nm处有最大吸收，磷脂、胆固醇等辅料无干扰。

　　1.5.2 测定方法 反相高效液相色谱(HPLC)法测定足叶乙苷含量。色谱条件为固定相Gemini C18 色谱柱(250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex)，流动相为甲醇-0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.0) (体积比为60：40)，流速：1.0mL/min，检测波长：285nm，柱温：30℃，进样量：20μL。

　　1.5.3 标准曲线制备 精密称取足叶乙苷对照品适量，用流动相溶解定容，制备成浓度为0.52mg/mL的足叶乙苷贮备液，精密量取上述贮备液，用流动相稀释成浓度分别为52、104、208、312、416μg/mL的系列标准品溶液，按照上述色谱条件进行操作。用测得的峰面积A与其浓度ρ进行回归，得到回归方程为A=0.1155ρ-0.2793，r=0.9998，结果表明足叶乙苷进样量在52～520μg/mL之间，线性关系良好。

　　　1.5.4 脂质体含量的测定 精密量取足叶乙苷脂质体0.1mL，加入体积分数20%Triton X?100乙醇液0.4mL，超声震荡1min使之混匀，加流动相稀释至2mL。按照上述色谱条件进行进样测定。同时进行方法学考察。

　　1.6 脂质体包封率的测定

　　精密量取足叶乙苷脂质体0.2mL，加至预先以生理盐水平衡的Sephadex G?50凝胶柱(1.0cm×12cm)上方，以生理盐水进行洗脱，流速为0.5mL/min，收集游离药物部分，混合，蒸干，残渣用流动相溶解定容至1mL，HPLC法测定。脂质体中总的药物含量按1.5.4方法测定。

　　以未被脂质体包封的游离足叶乙苷浓度〔ρu/(μg·mL-1)〕与总的足叶乙苷浓度〔ρt/(μg·mL-1)〕之比脂质体的包封率:pentrapment(%)=(1-ρu/ρt)×100。

　　1.7 长循环脂质体在血浆中的稳定性考察

　　1.7.1 模拟血浆内稳定性考察 精密量取脂质体1mL，加入1mLPBS，置透析袋(截留分子量12 000)中，封口后置于装有500mLPBS(pH7.4，0.05mol/L)的烧杯中，37℃恒温电磁搅拌。分别于10min、30min和1、1.5、2、3、4、6、8、10、24h取样5mL(同时补充同温空白介质5mL)，共3份，每份水浴蒸干，残渣用0.5mL流动相溶解，得样品。HPLC法测定样品中足叶乙苷的含量〔ρ1/(μg·mL-1)〕,对比脂质体中药物的含量〔ρt/(μg·mL-1)〕，测定渗漏率:pleakage(%)=50×ρ1/ρt×100。

　　1.7.2 血浆中稳定性考察 精密量取脂质体1mL，加入取自健康SD大鼠体内的大鼠血浆1mL，封口后置于装有500mLPBS(pH7.4，0.05mol/L)的烧杯中，按1.7.1方法操作，测定渗漏率。

　　2 结果

　　2.1 脂质体的形态和粒径分布

　　足叶乙苷脂质体呈乳白色。由透射电镜照片可见，脂质体外观规整，大小较均一(图1)。平均粒径为(180±26) nm，粒径分布范围较窄且符合正态分布(图2)。足叶乙苷普通脂质体和长循环脂质体的表面电荷分别为+(22.1±2.28) mv和-(8.58±2.07)mv。

　　2.2 足叶乙苷含量测定

　　足叶乙苷对照品和样品色谱图见图3，足叶乙苷脂质体平均含量为(4.78±0.22)mg/mL(N=10)，方法回收率为99.64%～100.4%，sR为0.39%(N=6)。

　　2.3 脂质体包封率的测定

　　由包封率的计算公式得到足叶乙苷长循环脂质体平均包封率为(88.71±8.2 )%(N=5)，脂质体和游离药物分离效果较好。

　　2.4 长循环脂质体在血浆中的稳定性考察

　　血浆中稳定性考察结果表明，相对于pH7.4缓冲液介质，足叶乙苷普通脂质体在大鼠血浆中药物渗漏迅速，而长循环脂质体在两种介质中药物渗漏率则没有明显区别。长循环脂质体在大鼠血浆中24h渗漏率为(46.72±2.61)%，而普通脂质体为(80.14±1.59)%。药物渗漏曲线见图4。

　　3 讨论

　　本文采用乙醇注入法，制备过程中通入N2除去乙醇，在乙醇挥发的同时脂质分散进入水相形成脂质体。该法制得的脂质体粒径适宜，工艺简单可行[6]。

　　以传统的卵磷脂、胆固醇制备的常规脂质体进入循环系统后，血浆调理素和高密度脂蛋白与磷脂分子相互作用，导致脂质体双层膜不同程度的破坏，药物渗漏。大部分脂质体被网状内皮系统(RES)吞噬，因而在血液循环中滞留时间较短，且大部分被动靶向于肝脏、脾脏。PEG2000?DSPE修饰脂质体膜后，可增加脂质体膜的柔性和表面的空间位阻，避免RES吞噬，从而增加脂质体的稳定性，延长药物在血液中的循环时间[7]。动物体内的代谢动力学试验和组织分布试验将进一步验证其长循环性质。

【】
  　　[1]Hande K R.Etoposide:Four decades of development of a topoiso?meraseⅡ inhibitor[J].Eur J Cancer,1998,34:1514.

　　[2]Smit E F,Carney D N,Harford P,et al.A phaseⅡ study of oral etoposide in elderly patients with small cell lung cancer[J].Thorax,1989,44:631.

　　[3]Hande K R.Etoposide pharmacology[J].Semin Oncol,1992,19(Suppl 13):3.

　　[4]Sengupta S,Tyagi P,Chandra S,et al.Etoposide encapsulated in positively charged liposomes:pharmacokinetic studies in mice and formulation stability studies[J].Phamacological Res,2000,42(5):459.

　　[5]Daemen T,Regts J,Meesters M,et al.Toxicity of doxorubicin entrapped within long?circulating liposomes[J].J Control Release,1997,44:1.

　　[6]Pons M,Fomdada M,Estelrich J.Liposomes obtained by the ethanol injection method[J].Int J Pharm,1993,95:51.

　　[7]Allen T M.Long?circulating(sterically stabilized)liposomes for targeted drug delivery[J].