新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养

                    作者：谢裕华 易春智 项晓伟 刘建仁

【摘要】  　　[目的]建立新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外培养的方法。[方法]选用出生后24h内的SD大鼠，分离大鼠大脑皮质细胞，加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，于倒置相差显微镜下观察细胞生长形态;取传代培养的第3代细胞，采用计数板计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长情况。[结果]从新生大鼠大脑皮质分离的细胞生长旺盛，星形胶质细胞形态典型，未见其他种类细胞生长。[结论]建立了一种简单易行的大鼠星形胶质细胞体外培养方法。

【关键词】  星形胶质细胞/病 细胞培养 体外的 大鼠

　　星形胶质细胞功能广泛，在神经系统发育、突触传递、神经系统内环境的稳定和新陈代谢等中枢神经系统的多种正常生理活动，以及神经疾病的病理机制中都起着十分重要的作用[1],神经胶质细胞是构成神经组织的两大类细胞之一，也是神经组织内的一种支持成分，其生物学作用受到重视。近年来发现星形胶质细胞除参与神经元与毛细血管间的物质运输以及神经组织损伤时分裂增殖胶质疤痕的形成外，也有营养神经及抑制神经生长的功能[2-3]。本实验建立了一种培养新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的方法,以期为神经胶质细胞膜功能蛋白质组学的研究建立基础。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 新生24h的SD大鼠2只，由广东省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)20030001。

　　1.2 主要试剂及仪器 高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶均由Hyclone公司提供;D?Hank?s(美国Simga公司);其他试剂均为国产分析纯。2323?2型CO2恒温培养箱(Sheldon Manufactruing.Inc，USA);3k?15低温离心机(美国Sigma公司);DL?CJ?IF超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);MPS 60倒置显微镜(Leika DMIRB);超纯水系统(MILLPORE，SAS 67120MOISHEMA，France);佳能A630数码相机;550型酶标仪(BIO?RAD公司)。

　　1.3 星形胶质细胞的原代培养 取新生SD大鼠(生后24h内)，断颈处死后浸入体积分数75%乙醇中消毒。以血管钳从后夹住颈部，用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨，再用眼科镊依次剥离，剔除脑膜及血管。取大脑(剔除海马部分)置于D?Hank?s液中，用镊子撕碎成糜状，眼科剪反复剪10min，用移液枪轻轻吹打20～30次，用1.25g/L的胰蛋白酶消化15min，然后以含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，1 000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养，第2天待细胞贴壁后换液1次并去除死细胞，以后每2～3d换液1次，细胞长成致密单层后进行传代培养。

　　1.4 传代培养 细胞生长了8～10d后,在显微镜下可见细胞长满瓶底90%。向每个培养瓶中加入1.25g/L的胰蛋白酶1mL消化3～4min，消化时在显微镜下密切观察,防止消化过度导致细胞死亡。待细胞脱壁后,用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化。将细胞悬液移入10mL离心管中,以1000r/min离心10min去上清后重新加入含血清培养基，吹打均匀，将细胞悬液接种至底壁面积为25cm2的培养瓶中，接种密度为1×106个/cm2，置培养箱中，37℃、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养,每2～3d换液1次，待细胞长满瓶底90%以上时再次进行传代培养。

　　1.5 细胞生长情况

　　1.5.1 计数板计数 将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。吸出少许细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min。镜下观察，计数板4大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：n细胞(个·mL-1)=n细胞总数/ 4×10 000。镜下偶见由2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

　　1.5.2 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法 取培养第3代细胞，制成单细胞悬液接种于96孔培养板，103～104/孔，每块板接种10孔，一共接种6块96孔培养板，每孔培养基总量200μL，37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养;分别于第1、2、3、5、7天加入2mg/mL的MTT液(50μL/孔),继续培养3h，吸出孔内培养液后，加入二甲基亚砜(DMSO)液150μL/孔，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min，使结晶物溶解，酶标仪检测各孔吸光度(D)值(检测波长490nm)。记录结果，绘制细胞生长曲线。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态 倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况与国外报道一致[4-5]，星形胶质细胞生长良好，细胞贴壁后开始生长繁殖，胞体不断增大，突触不断增多，并且细胞之间形成广泛的联系。原代分离的大鼠大脑皮层细胞在种植24h后，所有细胞均已贴壁，光晕明显。培养3～4d后，细胞数量增多。随着培养时间的延长，培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。传代后的细胞贴壁更快，一般6h左右大部分贴壁，第2天可以看到细胞开始铺开生长(图1-a)，第3天细胞突起明显，第5天细胞突触相互接触，细胞生长呈倍数增长，细胞数量和体积增大，细胞之间有广泛的接触(图1-b、c)，第7～8天细胞生长达到高峰(图-d)，以后细胞生长在形态和数量上变化不大。

　　3 讨论

　　星形胶质细胞是神经组织内数量最多、分布最广的胶质细胞。由于星形胶质细胞的分裂高峰发生在动物胚胎晚期及出生以后，故纯化星形胶质细胞的材料来源一般选择出生以后的新生动物[6]。在原代分离的脑神经细胞悬液中，不可避免有神经胶质细胞、神经元、成纤维细胞以及少量血细胞等。对于培养物中的神经元，一方面由于实验动物取自新生大鼠，神经元不再分裂;另一方面由于神经元在体外不易存活，需要胶原、多聚赖氨酸等黏附底物，更难以传代，所以通过传代即可除去神经元。其他如成纤维细胞、少量血细胞等由于所占比例少，随着传代而逐渐被淘汰。本实验采用简单易行的方法培养星形胶质细胞。既往发现，许多研究在培养细胞时加入特定的试剂如多种血清、神经生长因子等物质，对培养瓶也进行多种处理，这样一方面使实验过程复杂化，另一方面过多的物质对于培养的细胞会产生相关的影响，从而会对以后的实验造成影响。许多文献在提取大鼠神经胶质细胞过程中使用滤网，其目的是尽量减少杂质混入细胞悬液中。但是，使用滤网一方面在细胞滤过时必定使用较大的推力，容易造成细胞的变形和死亡，另一方面容易造成污染。本研究结果表明培养过程中最重要的是无菌操作，培养液选用高糖DMEM加入体积分数10%胎牛血清，在这种条件下细胞生长良好，达到体外培养星形胶质细胞的目的，基本上与体内形态一致，与张芸等[7]所得到的结果相似。对于细胞的形态学观察和记录可采用一种简单易行的方法，在倒置显微镜下得到较好的观察图片后，可以用数码相机的镜头对准目镜，通过拍摄而得到相关相片资料，其效果良好。

　　目前已经发现在体脑内星形胶质细胞间存在大量缝隙连接，允许小分子物质和多种离子等在细胞间的转运，胶质-胞外活性分子-神经元网络三者之间分子水平和功能的环路提示了星形胶质细胞网络具有重要的生理功能和病理意义[7-9]。本实验中所见星形胶质细胞的网络样连接则清晰地显示了星形胶质细胞之间物质、能量和信息交流的结构基础。本实验主要限于形态学方面的观察，对其生化特性和生理功能等尚需要从多方面进行研究。

【参考文献】
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