通冠胶囊对颈动脉球囊损伤后大鼠血清基质细胞衍生因子?1和血管内皮生长因子表达的影响

                作者：訾勇，张敏州，王磊，郭力恒，张军，温春瑜，杨澄

【摘要】  【目的】观察通冠胶囊对颈动脉球囊损伤模型大鼠基质细胞衍生因子?1(SDF?1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。【方法】复制大鼠左颈总动脉球囊损伤模型，将54只造模成功的SD大鼠随机分为通冠胶囊组(剂量为600 mg·kg-1·d-1)、模型组和辛伐他汀组(剂量为2 mg·kg-1·d-1);于术后第4、8、12周处死动物，采用苏木素—伊红(HE)染色及弹力纤维染色法观察血管壁增生情况，采用机图像分析内、中膜面积比值(Ai/Am)观察通冠胶囊对新生内膜形成的影响，采用酶联免疫吸附法检测SDF?1、VEGF水平。【结果】通冠胶囊组、辛伐他汀组与模型组比较，VEGF 、SDF?1水平在颈动脉球囊损伤后不同时段大鼠的血清中表达显著增高(均P<0?01)，8周时通冠胶囊组SDF?1表达较辛伐他汀组显著升高(P<0?05)，12周通冠胶囊组VEGF表达与辛伐他汀组比较，差异有显著性意义(P<0?05)。球囊损伤后4周内膜增生明显，8周形成的增生内膜有少量减少，12周时形成的新生内膜减少明显。通冠胶囊可使损伤后4、8、12周形成的新生内膜较模型组显著减少，Ai/Am较模型组显著降低(均P<0?01)。【结论】通冠胶囊可以促进大鼠颈总动脉球囊损伤后血清中SDF?1及VEGF的表达，并减少新生内膜的形成。

【关键词】  通冠胶囊/药;冠状动脉疾病/中药疗法;血管内膜/病理学;疾病模型，动物;大鼠

目前普遍认为血管内膜增生在粥样斑块以及血管成形术后再狭窄的形成过程中都起到了关键性的作用。内皮细胞结构和功能损伤是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)、冠心病介入后再狭窄(restenosis，RS)共有的始动病理机制[1-2]。血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞唯一的特异性促有丝分裂原,具有促进内皮细胞增殖、增加微血管通透性、诱导血管生成等多种功能[3]。基质细胞衍生因子?1(SDF?1)与其特异性受体细胞因子受体4(CXCR4)相互作用，构成SDF?1/CXCR4反应轴，对抑制动脉粥样硬化的发生起着重要的作用。VEGF 和SDF?1在动脉粥样硬化及冠心病介入治疗后再狭窄过程中的作用正越来越受到重视。本研究采用颈动脉球囊损伤大鼠模型观察通冠胶囊对SDF?1、VEGF表达的影响，探讨通冠胶囊保护血管内皮、防治冠心病介入治疗后再狭窄及促进血管新生的作用机制。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1?1主要试剂、仪器及药物VEGF 和SDF?1酶联免疫检测试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司(一抗)、上海西唐科技有限公司(二抗);Powerwave HT型酶标仪(美国Biotek公司);CHA?213W型显微镜(日本OLYMPUS公司);Image Pro?Plus 6?0图像分析系统;JD801型数码医学显微图像分析系统(江苏省捷达科技发展有限公司)、通冠胶囊由广东省中制剂科提供(生产批号：07110504);舒降之片由默沙东制药有限公司提供(辛伐他汀，生产批号：08023)。

　　1?2模型复制及实验分组采用内膜剥脱法制备大鼠颈动脉狭窄模型[4]。用100 mg/L水合氯醛溶液，按400 mg/kg 腹腔麻醉大鼠，取仰卧位固定，常规消毒大鼠颈前皮肤,取颈部正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 U/kg，寻找到左颈总动脉和颈外、颈内动脉分叉处，在左颈总动脉近心端暂时阻断血流，靠近分叉处用血管分离棒轻轻分离颈外动脉，其近心端和远心端各穿一4号丝线待用。从颈外动脉处将1?5 F Forgaty导管插入至颈总动脉约1?5 cm，在直视下观察球囊的插入深度，肝素生理盐水充盈球囊，缓慢回抽球囊至动脉分叉处，反复3次剥脱内膜。将导管撤出后，结扎颈外动脉近段，去除血管夹，恢复血流，查看颈总动脉和颈内动脉搏动是否良好。缝合伤口，送回动物观察室，腹腔注射青霉素预防感染。

　　选取雄性SD大鼠54只，SPF级，体质量180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(粤)2003?0001。造模后将大鼠随机分为3组各18只：辛伐他汀组(剂量为2 mg·kg-1·d-1)、通冠胶囊组(600 mg·kg-1·d-1)、模型组(给予10 mL·kg-1·d-1生理盐水)，各组分别于术后第4、8、12周取材，每个时间段每组各6只。

　　1?3样品采集及处理用100 mg/L水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠，取出损伤部位的左颈总动脉约2 cm长，磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗后置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋病理切片，每个标本均匀间断切片8张，切片厚度3 μm。切片行苏木素—伊红(HE)染色及弹力纤维染色。在光镜下观察血管内膜增生情况，以内弹力板和外弹力板为标准区分内膜、中膜和外膜。SDF?1、VEGF酶联免疫吸附检测具体操作方法及评判标准参照试剂盒说明书进行。

　　1?4图像分析及统计学处理在普通光镜下固定各种光学参数，对标本进行扫描，以TIFF格式存入电脑;用Image Pro Plus 6?0软件进行图像分析。通过血管HE染色及弹力纤维染色计算：内膜面积、中膜面积、内膜和中膜面积比值(intima area/media area，Ai/Am)。①在40倍视野偏振光光镜下，固定显微镜的各项光学常数，对损伤血管进行扫描，图像以TIFF格式存入电脑;②在Image Pro Plus 6?0环境下打开一幅图像，利用软件中的Count and Size功能自动计算出Ai/Am。采用数码医学显微图像分析系统在400倍放大倍数下,连续扫描5个视野,读取平均光密度值作为VEGF的相对表达量。

　　1?5统计学方法采用SPSS 11?5统计软件包进行数据处理，组间差异性比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验法。

　　2结果

　　2?1组织学观察正常大鼠颈动脉内膜为单层内皮细胞，中膜由4～5层环行排列呈波浪状的弹性膜和平滑肌细胞组成，外膜由结缔组织组成。球囊损伤后，可见动脉内皮剥脱，个别处内弹力板破裂，内弹力板由正常时的波浪状变平坦，失去弹性。球囊损伤后4周内膜增生明显，8周形成的增生内膜有少量减少，12周时形成的新生内膜减少明显。模型组球囊损伤后4周内膜增生达到高峰。通冠胶囊组损伤后4、8、12周Ai/Am较模型组显著降低(均P<0?01);与4周、8周同时段辛伐他汀组Ai/Am值比较差异无显著性意义(P>0?05)，与12周辛伐他汀组Ai/Am值比较，差异有显著性意义(P<0?05);辛伐他汀组的变化趋势与通冠胶囊组相似，与同时段模型组比较差异有显著性意义(均P<0?01)。结果见表1、图1、图2。表1各组大鼠损伤颈动脉不同时段Ai/Am的比

　　2?2各组大鼠血清VEGF水平比较表2结果显示，通冠胶囊组、辛伐他汀组术后4、8、12周VEGF水平与模型组比较，差异均有显著性意义(P<0?01)。4、8周VEGF水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异无显著性意义(P>0?05)。12周VEGF水平通冠胶囊组较辛伐他汀组显著增高(P<0?05)。

　　2?3各组大鼠血清SDF?1水平比较通冠胶囊组、辛伐他汀组术后4、8、12周SDF?1水平与模型组比较差异均有显著性意义(P<0?01)。术后4、12周SDF?1水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异无显著性意义(P>0?05);术后8周SDF?1水平通冠胶囊组与辛伐他汀组比较差异有显著性意义(P<0?05)。

　　3讨论

　　冠心病介入术后再狭窄的病理、生理过程研究广泛。研究表明[5]，由于球囊损伤后内皮细胞剥脱，内弹力板及血管中膜被拉伸撕裂，血管壁完整性受到破坏，内皮下基质暴露于血流，引发血小板黏附、聚集，继而形成血栓，这是经皮冠状动脉成形术(PTCA)后损伤血管早期的病理变化。此后，早期形成的血栓机化，血管中膜平滑肌细胞在多种生长因子和血管活性物质的刺激下，开始向内膜迁移增殖，同时分泌细胞外基质，新生内膜形成。而内膜增生是再狭窄的主要机制。研究发现内皮祖细胞(EPCs)在受损血管内皮的自我修复中发挥重要作用[6]，而VEGF既可促进EPCs动员，又可促使其归巢[7]。VEGF等细胞因子可能通过对骨髓源内皮祖细胞的正性调控,动员其进入外周血,促进其转化为成熟的内皮细胞,达到促进血管再生和增强血管内皮化的作用[8]。SDF?1能诱导骨髓和动员外周血CD34 造血干/祖细胞跨内皮迁移，这种趋化活性呈浓度依赖性[9]。SDF?1和VEGF具有相似的作用，在动物实验中他们能迅速动员造血干细胞和循环的内皮祖细胞[10]，这对于防治动脉粥样硬化、再狭窄及促进血管新生有重要意义。

　　通冠胶囊主要由黄芪、丹参等组成，具有益气活血通络之功。前期实验证实通冠胶囊能够抑制球囊损伤家兔血管后的平滑肌增殖[11]，升高心肌缺血小鼠一氧化氮合酶(eNOS)表达，促进NO活性，对内皮细胞具有保护作用[12]。

　　本研究结果提示，通冠胶囊对损伤后血管内膜的增生有明显抑制作用。通冠胶囊组、辛伐他汀组与模型对照组比较，术后4、8、12周VEGF、SDF?1水平差异均有显著性意义，在12周时VEGF的表达通冠胶囊组较辛伐他汀组显著增加，表明通冠胶囊可抑制血管内膜的增生，促进VEGF、SDF?1　表2各组大鼠不同时段血清VEGF水平比较①统计方法：单因素方差分析;①P<0?01，与模型组比较;②P<0?05，与辛伐他汀组同时段比较表达，通冠胶囊是否通过促进血管内膜VEGF、SDF?1的表达增殖从而促进EPCs的动员、归巢及分化到内皮损伤处而达到修复损伤动脉的作用，有待进一步研究证实。

【】
  　　[1]Endemann D H, Schiffrin E L? Endothelial dysfunction[J]. J Am Soc Nephrol,2004,15：1983?

　　[2]Lerman Amir.Restenosis： Another “dysfunction” of the endothelium[J]. Circulation,2005,111(1)：8?

　　[3]Neufeld G,Cohen T,Stela G,et al?Vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptors[J].FASEB J,1999,13：9.

　　[4] David A Julis,William Durante,Kelly J,et al?Heme oxygenase?1 attenuates vascular remodeling following balloon injury in rat carotid arteries[J].Atherosclerosis,2001,155：113.

　　[5]Powell J S,Clozel J P,Muller R K M?Inbibitors of ACF prevent myointimal proliferation after vascular injury[J].Science,1989,24：186.

　　[6] Imanishi T,Hano T,Matsuo Y, et al. Oxidized low?density lipoprotein inhibits vascular endothelial growth factor?induced endothelial progenitor cell differentiation[J].Clin Exp Pharmacol Physiol, 2003, 30(9)： 665.

　　[7]Segal M S,Shah R,Afzal A. Nitric oxide cytoskeletal induced alterations reverse the endothelial progenitor cell migratory defect associated with diabetes [J].Diabetes，2006,55(1)：102.

　　[8]Asahara T, Takahashi T, Masuda H, et al?　VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow?derived endothelial progenitor cells[J].Emboj, 1999,18(14)： 964.

　　[9]魏立，孔佩艳，陈幸华，等.阻抑正常骨髓基质SDF?1作用对HL?60细胞生物学性质的影响[J].第三军医大学学报，2004,26(23)：2158.

　　[10] Moore M A，Hattorl K ，Heissig B，et a1.Mobilization of endothelial and hematopoietic stem and progenitor cells by adenovector mediated elevation of serum levels of SDF?1，VEGF，and angiopoietin 21[J].Ann N Y Acad Sci，2001，938：36.

　　[11]祁建勇，张敏州，程康林,等.通冠胶囊对兔球囊血管成形术后血管病理形态的影响 [J].中医急症,2007，15(6)：630.

　　[12]陈俊林，吴伟康，韩玉莲,等.邓氏通冠胶囊改善缺血心肌供血的时效量效关系及NO机制研究[J].广州中医药大学学报,2007,24(4)：301