狼疮Ⅱ号对缺乏淋巴增殖基因狼疮鼠Th1/Th2细胞因子谱的影响

                     作者：吴元胜，欧阳杰，禤国维，梁德洪 

【摘要】  【目的】探讨中药狼疮Ⅱ号对缺乏淋巴增殖基因(MRL/lpr)狼疮鼠Th1/Th2相关细胞因子谱的影响。【方法】选用自发性系统性红斑狼疮(SLE)模型MRL/lpr狼疮鼠40只，随机分为空白对照组、狼疮Ⅱ号组(中药组，剂量为20 g·kg-1·d-1)、强的松组(西药组，剂量为6 mg·kg-1·d-1)、中西结合组(20 g·kg-1·d-1狼疮Ⅱ号+6 mg·kg-1·d-1强的松);连续用药8周后，采用Flowcytomix流式检测技术对血清中多种Th1/Th2细胞因子进行芯片式集成测定。【结果】与空白对照组比较，中西结合组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)水平显著降低(P<0?05);各组干扰素?γ(IFN?γ)、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)水平显著降低，且中西结合组两因子水平显著低于单纯中药组及西药组(P<0?05或P<0?01);各治疗组白介素?2(IL?2)水平显著升高，IL?17水平显著降低(P<0?05或P<0?01)，但3组间比较差异无显著性意义(P>0?05);各治疗组IL?4、IL?5、IL?10水平显著降低，且中西结合组IL?10水平显著低于单纯中药组和西药组(P<0?05或P<0?01);西药组和中西结合组IL?6水平显著降低(P<0?01)，且中西结合组IL?6水平显著低于西药组(P<0?05)。【结论】狼疮Ⅱ号可能通过调节Th1/Th2细胞因子的平衡，影响B细胞、T细胞过度活化而发挥治疗SLE的作用。

【关键词】  狼疮Ⅱ号/药;系统性红斑狼疮/中药疗法;细胞因子;疾病模型，动物;小鼠

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫病的原型代表，B细胞高度活化是其发病中最为关键的因素之一。B细胞异常活化、增殖和分化，导致B细胞多克隆激活，产生多种自身抗体，损伤自身组织和器官[1]。近年来，随着对细胞因子的深入研究，发现B细胞的活化受多种T细胞亚群及多种细胞因子尤其是白介素的调节，B细胞活化、增殖、分化的每一阶段都需要细胞因子的参与，细胞因子网络在B细胞过度活化和抗体产生中起着重要作用[1-3]。Th1/Th2细胞因子平衡代表着机体复杂的细胞因子网络，调整这个网络的平衡在SLE的治疗中具有一定的临床应用潜力。

　　缺乏淋巴增殖基因(MRL/lpr)狼疮鼠是一种较好的自发性SLE动物模型，其发病后症状与人类红斑狼疮相似，包括显著的血清自身抗体的出现、免疫复合物肾小球肾炎、血管炎等，对探讨SLE的发病机制、病理变化和治疗具有重要意义[4-7]。狼疮Ⅱ号是在经典名方六味地黄丸的基础上研制的改良验方，具有滋阴清热、凉血解毒的作用。本研究在前期运用该方治疗活动性SLE患者获得了较为肯定的临床疗效基础上[8-10]，采用基于微球技术的液相蛋白流式检测——Flowcytomix技术，探讨狼疮Ⅱ号对MRL/lpr狼疮鼠外周血Th1/Th2相关细胞因子谱的影响，现将结果报道如下。

　　1材料和方法

　　1?1实验动物缺乏lymphoproliferation(lpr，淋巴增殖)基因(MRL/lpr)小鼠购自院上海实验动物中心，合格证号：SCXK(沪)2007?0005，雌性，12周龄，体质量(25?2±2?8)g，饲养在广东省医学实验动物中心无特定病原体(SPF)级实验动物室层流柜，室内保持(25±1)℃，自由饮水、进食，采用12 h ∶12 h昼夜间断照明，每周换水3次，换垫料2次，SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。

　　1?2药物中药复方狼疮Ⅱ号由广州中医药大学第二附属制剂科提供，该方由山萸肉、生地、茯苓、泽泻、牡丹皮、青蒿、甘草等组成，先后加蒸馏水1 000 mL和500 mL，煮沸2 h和1?5 h，合并2次药液，过滤，旋转蒸发浓缩，制成含生药浓度200、400 mg/mL两种浓度的水煎剂，高压灭菌后备用;强的松(醋酸泼尼松片)由广东三才医药集团有限公司生产(批号：44023869)。

　　1?3主要试剂和仪器粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)、干扰素?γ(IFN?γ)、白介素?1α(IL?1α)、白介素?2(IL?2)、白介素?4(IL?4)、白介素?5(IL?5)、白介素?6(IL?6)、白介素?10(IL?10)、白介素?17(IL?17)、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)的mouse Th1/Th2 Flowcytomix可溶性细胞因子检测试剂盒(由奥地利Bender Medsystems公司提供); FACSCalibur 流式细胞分选仪(美国BD公司);MAVM 0960R密理博真空抽滤装置(美国Millipore 公司);Flowcytomix Pro Software 2?1检测软件(由奥地利Bender Medsystems公司提供)。

　　1?4动物分组与治疗方法40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组，予以生理盐水灌胃;中药组，予以狼疮Ⅱ号20 g·kg-1·d-1剂量灌胃(人等效剂量的2倍);西药组，予以强的松混悬液6 mg·kg-1·d-1剂量灌胃;中西结合组，予以狼疮Ⅱ号20 g·kg-1·d-1加强的松混悬液6 mg·kg-1·d-1剂量灌胃。各组灌胃给药容积20 mL/kg，西药组、中西结合组分别给予各药的生理盐水混悬液。

　　1?5观察指标及标本处理从13周龄起，上述各组饲养、用药8周，末次给药24 h后的上午9∶00时至10∶00时同批各鼠眶后静脉丛采血，置于具有肝素的试管中，离心，取血清置-20℃保存。

　　1?6Flowcytomix流式检测将待检样品从-20℃冰箱中取出，置于37℃复苏30 min;按流式微球阵列检测试剂盒操作说明准备好分析缓冲液、标准品、微球、生物素偶联剂及亲和素标记藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，以每孔50 μL分析缓冲液预湿96孔微孔板，在标准曲线孔加25 μL相应浓度的标准品;空白孔加25 μL分析缓冲液，样本孔加25 μL待测标本。同时每孔加入25 μL混合的微球和50 μL生物素偶联剂，封板膜封板，避光室温孵育2 h;真空抽干，每孔加入100 μL检测缓冲液，充分洗涤2次，加入100 μL检测缓冲液和50 μL亲和素标记PE，继续孵育1 h;真空吸干，每孔加100 μL检测缓冲液，充分洗涤2次;加入200 μL检测缓冲液，反复吹打后，加入300 μL检测缓冲液并转移到流式上样管。上机收集标本时，保证低或中流速，避免频繁转换流速，以防造成微球的偏移。按照标准孔1~7、空白孔、样本孔的顺序收取标本数据。

　　FACSCalibur 流式细胞仪测定荧光强度，使用PE阳性和阴性对照微球设定仪器参数(电压和补偿)。检测前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)时，需要调节不同荧光通道FL2 和 FL3(690 nm)的参数。流式分析时，先建立 FSC/SSC(FSC为X轴，SSC为Y轴)双参数直方图及FL2/FL3(FL2为X轴，FL3为Y轴)双参数直方图。

　　1?7数据分析及统计学方法实验复孔独立重复1次，将标准品和待检品捕获数据转入Flowcytomix Pro分析软件，建立各细胞因子荧光值与其实际浓度的标准曲线，各待测样本细胞因子浓度根据其荧光值由标准曲线自动读出。采用SPSS 13?0 统计软件进行分析。

　　2结果

　　2?1死亡情况干预6周后空白对照组MRL/lpr狼疮鼠因发病较早死亡1只。

　　2?2参数调节结果见图1(彩图页第427页)。调节 FSC 和 SSC 的参数后(采用线性模式)，R1(IL?1α、 IL?2、 IL?5 、IL?6、IL?10)和R2(IFN?γ、TNF?α 、GM?CSF、IL?4、IL?17)微球出现在 FSC/SSC 直方图内(图1-a);调节 FL2 和FL3的参数后(采用对数模式)，R1(红色)和R2(绿色)的微球出现在 FL2/FL3 直方图内(且需要使微球位于图中的左边界)。其中5群红点分别表示5种细胞因子(图1-b)，5群绿点分别表示另5种细胞因子(图1-c)。

　　2?3各组小鼠血清Th1型细胞因子检测结果表1结果显示，中西结合组GM?CSF水平较空白对照组低，差异有显著性意义(P<0?05)，其他治疗组GM?CSF水平与空白对照组比较差异无显著性意义(P>0?05);各治疗组IFN?γ、TNF?α水平均低于空白对照组，差异有显著性意义(P<0?05或P<0?01)，且中西结合组IFN?γ、TNF?α水平均较中药组和西药组低，差异有显著性意义(P<0?05或 P<0?01);各治疗组IL?2水平均高于空白对照组，差异有显著性意义(P<0?05或P<0?01)，但3组间比较差异无显著性意义(P>0?05);各治疗组IL?17水平均低于空白对照组，差异有显著性意义(P<0?05或P<0?01)，但3组间比较差异无显著性意义(P>0?05)。

　　2?4各组小鼠血清Th2型细胞因子检测结果表2结果显示，各治疗组IL?4、IL?5、IL?10水平均低于空白对照组，差异有显著性意义(P<0?05或P<0?01)，且中西结合组IL?10水平均较中药组和西药组低(P<0?05或P<0?01);西药组和中西结合组IL?6水平均低于空白对照组，差异有显著性意义(P<0?01)，且中西结合组IL?6水平显著低于西药组(P<0?05)。表1各组小鼠血清Th1型细胞因子检测结果比较表2各组小鼠血清Th2型细胞因子检测结果比较

　　3讨论

　　Mosmann等[11]发现CD4+Th细胞可为功能不同的Th1和Th2亚群，它们各自产生特征性细胞因子，并在介导机体免疫应答中扮演着不同的角色。IFN?γ、TNF?α、IL?1α、IL?2、 IL?17、GM?CSF等Th1细胞因子的主要功能是介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化和迟发型超敏反应。IL?4、IL?5、IL?6、IL?10等Th2细胞因子的主要功能是介导体液免疫，促进B细胞生长、活化和分化。Th1细胞分泌IFN?γ，而不分泌IL?4;Th2细胞正好相反，通常以这两种细胞因子作为鉴别Th1、Th2的标志[12]。SLE发病过程中存在明显的细胞因子失调、细胞因子谱偏移，许多种细胞因子的异常对SLE的发生发展及其转归过程有着十分重要的意义。Kyriakos等[13]提出了细胞因子参与SLE的免疫调节紊乱的模型：疾病早期，是Th1型细胞因子在发挥作用，一旦T细胞被自身抗原激活，就产生自身抗体并累及终末器官，同时，INF?γ诱导单核细胞活化，产生前炎症因子IL?1、TNF?α，而且单核细胞也分泌IL?6、IL?10，促进B细胞分化，产生大量自身抗体，病情进一步发展。Th1/Th2两个亚群的调节和平衡作用，在很大程度上是由Th1和Th2类细胞因子之间的相互作用所介导的。由于细胞因子彼此之间相互诱导、协同、叠加或拮抗形成了非常复杂的作用网络，对单一细胞因子的检测分析难以体现和说明机体细胞因子网络状态以及复方中药的作用机理。

　　基于微球技术的液相蛋白流式检测——Flowcytomix技术，类似于流式微珠阵列(cytometric bead array，CBA)技术，但检测指标更多;较之于传统的单克隆抗体酶联免疫吸附(ELISA)检测技术，多项指标的检测只需制备一组标准曲线，一次采样，大大节省样本，缩短检测时间，提高效率，具有更高的灵敏度和更好的重复性，更重要的是能最大限度地消除不同反应体系所带来的各种误差和同一反应体系内各细胞因子间的交叉反应。较之于Luminex液相蛋白芯片技术，该技术实验过程在普通的流式细胞仪上即可完成。

　　本研究对中药复方狼疮Ⅱ号等不同措施干预治疗MRL/lpr狼疮鼠模型后其外周血多种Th1/Th2细胞因子的影响进行芯片式集成检测，从整体和同步的角度观察了各干预措施对MRL/lpr狼疮鼠细胞因子网络的调节模式。结果表明，10种细胞因子中，空白对照组IFN?γ、TNF?α、IL?17、IL?4、IL?5、IL?10水平高于各治疗组(P<0?05或P<0?01)，其IL?2水平则低于各治疗组(P<0?05或P<0?01);中西结合组IL?6、IL?10、IFN?γ和TNF?α水平显著低于单纯中药组和西药组(P<0?05或P<0?01)。皮质激素是目前临床治疗SLE的主要药物之一，但其具体作用机制并不十分明确。本研究结果提示糖皮质激素能降低MRL/lpr狼疮鼠IFN?γ、IL?6、IL?10水平，并在一定程度上逆转MRL/lpr狼疮鼠的Th1偏移，调节Th1/Th2类细胞因子网络平衡，中药治疗具有一定的协同调节作用。值得注意的是各治疗组IL?2水平差异无显著性意义，但显著高于空白对照组，提示中药对MRL/lpr狼疮鼠IL?2表达水平具有提高作用，与糖皮质激素比较其是否具有浓度依赖性的双向调节作用尚需深入研究。

　　本研究初步揭示了中药复方狼疮Ⅱ号对MRL/lpr狼疮鼠血清10种细胞因子谱的影响，我们认为Flowcytomix技术能同步、客观地反映Th1/Th2细胞因子的变化和平衡状态，有利于探讨细胞因子间的相互影响和网络效应。狼疮Ⅱ号可能通过调节Th1/Th2细胞因子网络的平衡，影响B细胞、T细胞过度活化，主要抑制IFN?γ和前炎性因子TNF?α的分泌、提高IL?2表达水平而发挥治疗作用。由于细胞因子网络调控的复杂性以及中药复方多靶点作用机制的特点，狼疮Ⅱ号更确切的作用机制有待深入验证和探讨。

【】
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