补骨脂素对乳腺癌MCF?7和MDA?MB?231细胞体外作用的比较研究

                 作者：谭敏，孙静，赵虹，何青莲，胡少为，李楚天 

【摘要】  【目的】观察并比较补骨脂素对人乳腺癌MCF?7和MDA?MB?231细胞的抑制作用。【方法】以不同浓度的补骨脂素(25?000、12?500、6?250、3?125 μg/mL)对人乳腺癌细胞株MCF?7[雌激素受体(ER)阳性]和MDA?MB?231(ER阴性)进行体外抑制实验，运用流式细胞仪观察细胞的周期变化,Annexin V和碘化丙锭(PI)双染法观察细胞凋亡情况,基因芯片检测补骨脂素对两种人乳腺癌细胞基因表达谱的影响。【结果】补骨脂素对人乳腺癌细胞株MCF?7有显著抑制作用(P<0?05)，半数抑制浓度(IC50)为15?160 μg/mL;作用24 h后，S期细胞明显减少，G1、G2期细胞增加，早期凋亡细胞明显增多。而补骨脂素对MDA?MB?231细胞无明显抑制作用，仅早期凋亡细胞增多。人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片杂交结果显示，补骨脂素可以使MCF?7细胞出现1 053个差异表达基因，其中表达上调的有456个，表达下调的有657个。【结论】补骨脂素对ER阳性的乳腺癌MCF?7细胞具有一定的抑制作用，其抑制肿瘤细胞生长的机理可能与将肿瘤细胞阻止在G2期相关。

【关键词】  补骨脂素/药;乳腺肿瘤/中药疗法;细胞凋亡;基因表达调控;细胞培养

补骨脂素是从中草药补骨脂中分离提取的有效成分。研究表明补骨脂素对人乳腺癌、胃癌、宫颈癌、舌癌、黏液表皮样癌及白血病等细胞株均有体外生长抑制及细胞毒作用[1]，但其作用机理尚需进一步研究。本研究拟用补骨脂素对雌激素受体(ER)阳性人乳腺癌细胞株MCF?7、ER阴性人乳腺癌细胞株MDA?MB?231进行体外抑制实验，同时运用流式细胞仪检测癌细胞的增殖及早期凋亡情况，并检测用药前后基因表达谱的变化，将两种细胞株对补骨脂素的反应进行比较，观察补骨脂素是否对各种类型乳腺癌细胞均有抑制作用，进一步阐明补骨脂素对乳腺癌细胞的抑制机理。现将结果报道如下。

　　1材料和方法

　　1?1材料人乳腺癌MCF?7细胞株、MDA?MB?231细胞株均由南方医科大学引进;补骨脂素购于生物制品研究所;流式细胞仪早期凋亡检测试剂盒Annexin V/碘化丙锭(PI) apoptosis Kit 为美国Caltac 公司产品;细胞周期检测用PI为美国Beckman Cuiter公司产品;噻唑蓝(MTT)试剂为Sigma公司产品;晶芯?22K人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V1?0，共有21 522条70 mer(monomerie unit，单体单元)长度的OligoDNA，为博奥生物公司产品;Lux Scan 3?0图像分析软件为CapitalBio公司产品;其他基因芯片检测仪器及分析系统均为博奥生物公司产品。

　　1?2MTT法测定补骨脂素对两种乳腺癌细胞株生长的影响分别取MDA?MB?231及MCF?7两种细胞株对数生长期细胞0?5×105分别接种于96孔培养板，100 μL/孔，培养过夜后，分别加入25?000、12?500、6?250、3?125 μg/mL补骨脂素，培养24 h，加MTT后在酶标仪上以570 nm波长检测D值，每组检测8孔。按公式抑制率：p抑制=(1-D实验组/D对照组)×100% 。以半数抑制浓度(IC50)计算软件计算IC50。

　　1?3流式细胞仪检测细胞周期改变将培养的两种细胞株按上述4个浓度加入补骨脂素，设空白对照组，培养24 h后收集细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞1～2次，1 500 r/min离心,弃上清，加体积分数75%乙醇1 mL固定，-20℃过夜后，PBS洗细胞1~2次，加500 μg PI 染液，4℃孵育30 min，上流式细胞仪检测。

　　1?4流式细胞仪检测细胞早期凋亡分别收集4个浓度及空白对照组细胞，用PBS洗细胞1~2次，1 500 r/min离心，弃上清，将细胞悬于Binding Buffer中，加5 μL Annexin V和10 μL PI，室温避光孵育5 min，上流式细胞仪检测。

　　1?5基因表达谱芯片检测差异表达基因Trizol一步法分别提取两种细胞株给药组(补骨脂素浓度为12?5 μg/mL)及空白对照组细胞中的总RNA，按说明书方法进行。两种细胞株分别以Cy5?脱氧胞苷三磷酸(Cy5?dCTP)标记补骨脂素作用组，Cy3?dCTP标记空白对照组为第1对样本;荧光交换，以Cy3?dCTP标记补骨脂素作用组，Cy5?dCTP标记空白对照组为第2对样本。两对样本分别在两张22K晶芯?人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片上，42℃杂交过夜。杂交后清洗甩干用于扫描。芯片使用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行扫描，获取每个阵列、每种染料(Cy3和Cy5)的扫描图像。使用基因芯片数据提取软件从扫描图像中提取数据。进一步分析得出Cy3、Cy5的荧光数字信号值及Cy3∶Cy5比值(ICy3∶ICy5)，并分别计算出荧光交换2次重复试验的平均值，选出差异表达的基因并分析。

　　1?6统计学方法采用SPSS 15?0统计软件，各试验组比较采用方差分析、多重比较。

　　2结果

　　2?1各组对两种乳腺癌细胞株生长的影响各个浓度补骨脂素对人乳腺癌MCF?7细胞均有抑制作用，与空白对照组比较差异有显著性意义(P<0?05)，IC50为15?160 μg/mL。25?000 μg/mL浓度组抑制率高达90?5%，而各个浓度的补骨脂素对人乳腺癌MDA?MB?231细胞均无明显抑制作用。结果见表1。

　　2?2不同浓度补骨脂素对两种乳腺癌细胞增殖周期的影响表2结果显示，各浓度补骨脂素作用于MCF?7细胞24 h后，与空白对照组比较S期细胞比例减少，G1比例增加，2个高浓度组G2比例亦表1各组对两种乳腺癌细胞株生长的影响表2不同浓度补骨脂素对两种乳腺癌细胞增殖周期的影响

　　2?3不同浓度补骨脂素对两种乳腺癌细胞株早期凋亡的影响

　　表3结果显示，较低3个浓度补骨脂素均可使MCF?7细胞早期凋亡增加，经25?000 μg /mL浓度补骨脂素作用后细胞早期凋亡减少，可能该浓度的补骨脂素产生毒性作用，直接造成细胞坏死。各浓度补骨脂素均可使MDA?MB?231细胞早期凋亡增加,但增加的幅度较小。

　　2?4基因表达谱芯片改变取两次实验的平均值中ICy3∶ICy5比值大于2或小于0?5的为差异表达基因。补骨脂素作用MCF?7细胞24 h后，出现了1 053个差异表达基因，其中表达上调的有456个，表达下条的有657个(见彩图页第427页)。发生明显差异表达的基因主要与细胞凋亡、细胞周期调控、核酸转译调节、转译因子活性、核苷酸转移酶活性、血管收缩调节等有关。补骨脂素作用于MDA?MB?231细胞24 h后，仅出现了8个差异表达基因，根据统计数据分析，认为这么小的变化属于误差范围内，而非补骨脂素作用引起表3不同浓度补骨脂素对两种乳腺癌胞株早期凋亡的影响

　　3讨论

　　研究表明，处于G2/M期的细胞对于化疗及放疗都很敏感[2]。因此设法使细胞停滞在G2期会提高肿瘤细胞对的敏感性。报道[3-4]，多种抗癌药物诱导肿瘤细胞的抑制作用与细胞周期G2/M期阻滞有关。本研究中流式细胞仪检测结果表明，经补骨脂素作用24 h后，MCF?7细胞S期细胞百分数明显减低，G1、G2期细胞百分数增高，说明补骨脂素对MCF?7细胞的抑制作用可能是将细胞阻滞在G1、G2期。当补骨脂素剂量加大时，G2期细胞增加，增殖抑制实验亦显示补骨脂素对乳腺癌MCF?7细胞抑制率也明显增加，认为可能是药物作用于G2期细胞，使细胞产生明显的增殖抑制及凋亡。而补骨脂素作用于MDA?MB?231细胞株后，虽然出现G1期细胞减少，S期细胞增加，但未检测到G2期细胞，说明此细胞株在G2期停留时间短暂，并且补骨脂素不能使MDA?MB?231细胞在G2期滞留，药物无法实现对细胞的杀伤及抑制作用。体外抑制实验结果亦显示，不同剂量的补骨脂素对ER阴性的MDA?MB?231细胞均未出现明显抑制作用。有文献报道[5]，雌激素类药物雌二醇和植物性雌激素二羟异黄酮均可抑制MDA?MB?231细胞生长，促使其凋亡，流式细胞仪检测发现其均可使MDA?MB?231细胞G2/M期阻滞。本研究比较补骨脂素对两种乳腺癌细胞株的作用亦发现，能否抑制乳腺癌细胞生长与药物能否将癌细胞阻止在G2期密切相关。

　　研究证实多种中草药有效成分可以诱导乳腺癌细胞发生凋亡[6-7]。Vowels等[8]在8?甲氧基补骨脂素对T淋巴细胞和单核细胞系作用研究中发现其能诱导细胞发生凋亡，并随药物浓度加大凋亡细胞百分数也显著增加。本研究发现3?125、6?250、12?500 μg /mL浓度的补骨脂素作用24 h后，均可以使乳腺癌MCF?7细胞和MDA?MB?231细胞产生早期凋亡，提示补骨脂素有诱导乳腺癌细胞早期凋亡的作用。但对MDA?MB?231细胞作用较弱，故未能引起肿瘤细胞增殖抑制。

　　基因芯片技术可以在基因组范围内对组织细胞的基因表达谱进行研究，为肿瘤发生中多基因改变的分子机制研究提供有力工具[9]。研究报道,多种中草药可通过改变乳腺癌细胞的基因表达谱而达到抑制肿瘤细胞的作用[10-11]。本研究采用高通量、快速、敏感的人类基因表达谱基因芯片检测方法，检测了经补骨脂素作用后，人乳腺癌MCF?7细胞及MDA?MB?231细胞基因表达谱的改变，并比较补骨脂素对两种细胞系基因表达谱的影响。结果显示，经过补骨脂素作用后，乳腺癌MCF?7细胞出现差异表达的基因共有1 053 个(占晶芯?22K人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V1?0的4?78%)。其中表达上调的有456个(43?3%，ICy3∶ICy5>2?0)，表达下调的有657(56?7%,ICy3∶ICy5<0?5)个。通过初步分析，发现补骨脂素对MCF?7细胞增殖抑制过程差异表达明显的基因主要与细胞凋亡、细胞周期调控、核酸转译调节、转译因子活性、核苷酸转移酶活性、血管收缩调节等基因有关;表明补骨脂素对MCF?7细胞增殖的抑制及抗肿瘤的机制还有赖于众多基因的辅助、协调，经多步骤、多层次的作用过程而实现。而对乳腺癌MDA?MB?231细胞作用后未出现明显差异表达基因，与其对MDA?MB?231细胞未出现抑制作用相一致，说明补骨脂素未能影响MDA?MB?231细胞的某个启动基因，无法引起一系列的基因改变而达到细胞抑制作用。

【文献】
  　　[1]郭江宁，吴侯，翁新楚，等.补骨脂中活性成分的提取分离与抗癌实验研究[J].中药材，2003，26(3)：184.

　　[2]杨军，Steve Yi, 王健伟，等.HIV?1 Vpr基因在肿瘤细胞中诱导G2期停滞、细胞致死效应及其核定位功能研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，2000，14(3)：223.

　　[3]杨华，蔡于琛，庞冀燕，等.苯并呋喃类木脂素衍生物通过抑制细胞周期蛋白质活性诱导MCF?7细胞G2/M期阻滞及凋亡[J].药学学报，2008，43(2)：138.

　　[4]凌晖，苏琪，廖前进，等.Cdc25C cyclin B1在二烯丙基二硫化物诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用[J].肿瘤临床，2008，35(22)：1299.

　　[5]侯倩，李玮玮，朱萧玲，等.雌二醇、二羟异黄酮对乳腺癌MDA?MB?231细胞周期和增殖活性的影响[J].技术与工程，2006，17(6)：2644.

　　[6]李国元.桃儿七根醇提取物对人乳腺癌MCF?7细胞增殖和凋亡的影响[J].中国新药杂志，2006，15(13)：1064.

　　[7]李庆林，骆宏丰，方念白.椎茸的乙酸乙脂提取物诱导人乳腺癌MCF?7细胞凋亡的作用[J].中国药通报，2006，22(8)：1001.

　　[8]Vowels B R，Yoo E K，Gosparro F P.Kinetic analysis of apoptosis induction in human cell lines by UVA and 8?MOP[J].Photochem Photobiol,1996，63(5)：572.

　　[9]Van’t Veer L J,Dai H,Van de Vijver M J,et al?Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer[J].Nature,2002,415：530.

　　[10]李冬云，高志捷，张开泰，等.利用基因芯片技术研究薯蓣皂苷抗乳腺癌的作用机制[J]. 临床肿瘤学杂志，2006，10(11)：724.

　　[11]章平，毛玉昌，孙斌，等.沙棘籽渣黄酮诱导乳腺癌细胞凋亡相关基因的表达谱变化[J]. 癌症，2005，24(4)：454.