反义核酸抗肝炎病毒研究进展
摘要 病毒性肝炎的一直是困扰人类的一个难题。目前可利用的药物仍屈指可数．反义核酸技术的为病毒性肝炎的治疗带来了新的希望。利用反义DNA，反义RNA和核酶技术来抑制乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒，在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究，为临床应用反义核酸治疗病毒性肝炎奠定了基础。
关键词 反义核酸，抑制，肝炎病毒学
病毒性肝炎是人类与其长期抗争的恶魔，迄今已发现有7种类型。由于病毒性肝炎的传染性强，尤其是乙型及丙型病毒性肝炎可形成慢性感染，造成肝细胞的持续损伤，加重肝脏病变，常导致病情反复发作，长期迁延不愈，部分病人可发展成肝硬化和肝癌，危害极大。近年来，对病毒性肝炎的研究有较大的进展，但能有效治疗病毒性肝炎的临床药物仍屈指可数，尤其是对慢性乙型及丙型病毒性感染，临床可用的药物仍是各型干扰素，对有选择性的病人来说，其治愈率也只有30％～40％［1］。因此寻找一种有效的抗肝炎病毒药物已成为迫在眉睫的问题。
由于病毒的遗传物质不同于宿主细胞，从基因治疗的角度去发现新的抗病毒药物已成为近几年来的研究热点。反义核酸技术是一种新的基因治疗技术，包括反义寡核苷酸（ASON），反义RNA（asRNA）及核酶三大部分。反义寡核苷酸是一段反义的DNA序列，能与特异性的靶序列互补，抑制靶基因的表达。由于它特异性强，毒副作用小而成为人们研究抗病毒药物的热点。近几年来已有几种抗病毒反义寡核苷酸药物进入临床试验阶段。反义RNA是指一段与mRNA互补的RNA分子，是通过将正常cDNA反向插入到启动子下游后转录产生的。核酶是一种小的RNA分子，能以序列特异的方式在特定的位点断裂RNA分子，从而阻断特异蛋白的表达。核酶的抗病毒作用也引起了研究者的广泛兴趣和关注。本文主要对近几年来应用反义寡核苷酸，反义RNA和核酶技术抗肝炎病毒的研究进展作一简要综述。
1 反义核酸抗乙型肝炎病毒
病毒性乙型肝炎（HBV）以其感染面广，慢性化和难以治愈而成为临床治疗的难点。目前，全世界约有3亿人感染HBV，我国乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的携带率占全国人口的9.8％，占全世界感染者的1／3强。干扰素是目前临床上唯一可用于治疗HBV感染的药物，但治疗效果不好，随着反义寡核苷酸技术的产生和发展及对HBV基因结构，功能和复制等主要环节的认识和了解，应用ASON来抑制HBV基因的复制和表达在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究。体外研究主要采用转染了HBVDNA并能长期稳定分泌病毒的肝癌细胞系进行的（HepG2，Huh7等）。分别针对HBV基因的吸附、转录、反转录、翻译和包装等阶段设计出各类ASON，体外抑制HBV的复制．主要的靶部位有PreS、DR1、Pol、SP启动子转录mRNA帽区、S基因、C基因、PolyA增强信号区、RNA前导序列等，针对这些部位设计的ASON均能不同程度的抑制HBsAg，HBeAg或HBcAg的表达，对病毒DNA也具有不同程度的抑制作用［2，3］。Korba等［4］针对以上不同部位合成了56条不同的硫代ASON（14～23nt），分别检测了它们对HepG2.2.15细胞中HBsAg，HBeAg，HBcAg及HBVDNA的抑制效果，结果表明：包含S基因起始编码子的ASON均能有效抑制HBsAg的产生和病毒颗粒的释放，但不影响细胞内HBV的复制；针对C基因的ASON能抑制病毒颗粒的产生和细胞内HBcAg和HBVDNA复制中间体的水平；针对HBV包装信号的茎环结构上游的ASON能最有效的抑制HBV的复制，但针对HBeAg和HBV聚合酶基因区的ASON却不能影响HBV的复制。Goodarz等［5］针对HBV基因S区的5个位点（SP2启动子转录mRNA帽区，Pre-s2基因内部，S基因翻译起始区，S基因起始区下游10个碱基区和S基因内部）设计了6段ASON，以17.4μmol／L的终浓度与PLC／PRF5共同孵育72h后检测HBsAg的分泌量，结果发现，针对前4个位点设计的ASON对HBsAg有明显的抑制作用，其中以S基因翻译起始区的作用最强，抑制率达96％。我国姚志强等［6］的研究也表明针对HBVmRNASP2增强子帽区，polyA增强信号区的硫代ASON能有效抑制HBsAg的产生，抑制率达85％～90％，对HBeAg的抑制率也近50％～60％。国内还有其他一些单位也展开了类似的工作。由 于缺乏一个很好的动物模型，对抗HBV反义寡核苷酸的体内作用研究进展较慢。1993年，Offensperger等［7］第一次用针对PreS基因5′区的反义寡核苷酸AS2以20μg每克体重的剂量腹腔注射到鸭肝炎病毒（DHBV）感染的北京鸭中，连续10d，DHBV的复制几乎被完全抑制，血清中的DHBsAg及肝中的HbcAg也消失了。Moriya［8］等用一个转染了的HBVX基因的肝癌小鼠做模型，将一段含HBVX基因起始编码子的硫代ASON腹腔注射到小鼠体内，每周3次，连续8周，能有效的抑制肝脏HBVX基因的表达，阻止小鼠癌细胞恶性化。这一研究表明针对HBVX基因的ASON也许可用于阻止HBV感染成肝癌。
ASON的稳定性及透膜性是影响ASON作用的一个重要因素．通过对ASON进行各种化学修饰能有效地提高它在细胞内的稳定性，这些修饰主要是对磷酸二酯键中的氧原子进行各种取代，包括用硫基、甲基、甲氧基、乙氧基等取代，以提高ASON对核酸酶的抗性，硫代是目前最常用的修饰方式。ASON的透膜性直接影响到细胞摄入ASON的量，因而是目前进行ASON研究的一个热点。在肝细胞的表面有独特的无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R），将ASON连接到ASGP-R配体上，能定向地将ASON导到肝细胞，增加肝细胞对ASON的摄取量［9］。目前人们已对许多肝细胞特异的ASON载体进行了研究［10］，这为更进一步地进行反义寡核苷酸的体内和临床研究奠定了基础。由于反义RNA能在转染的细胞中连续、稳定地表达，对整合的病毒能提供长期的治疗效应，因此这一技术也被用于抑制HBV的复制．Wu等［11］构建了三个互补于HBsAgmRNA整个编码区（1.4kb），1.0kb和5′区的582bp的反义RNA表达质粒，在体外翻译系统，三个反义RNA均能以浓度依赖的方式抑制HBsAgmRNA的翻译，进一步将其克隆到哺乳动物细胞表达载体上，转染到Hep3B细胞，几乎完全阻抑了HBsAg的产生，转染后抑制率持续10个月左右。在反义RNA表达的细胞，HBVmRNA的水平显著低于对照细胞，这表明反义RNA抑制HBsAg合成部分可能是通过降低HBVmRNA水平而起作用的。这一研究第一次证明了反义RNA对HBV基因表达的抑制作用，也为治疗HBV感染提供了一条新的途径。
利用核酶抑制HBV在体外也进行了一些研究。Beck等［12］针对HBV基因设计了几个锤头型核酶，在体外能有效的断裂HBV基因。将HBV表达质粒和核酶共转染到Huh7细胞中，发现在细胞内核酶只能中等程度抑制HBV前基因组的产生，而当细胞裂解后，核酶能有效的断裂HBV前基因组RNA，尤其当用蛋白酶K和酚抽提后，核酶的活性大大提高，这可能是由于细胞内存在着一些蛋白质，与基因结合，从而抑制了核酶与靶RNA的杂交；另外，细胞内Mg2＋的浓度太低也可能是影响核酶活性的一个原因．总之，核酶在体内的活性是一个很复杂的问题，仍需进行大量的研究。
2 反义核酸抗丙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒（HCV）为一正的单链RNA，与乙型肝炎病毒感染一样，HCV感染也易慢性化，并进一步发展成为肝癌．估计世界上约有1％的人感染了HCV，20％～40％的病人将发展成肝硬化或肝癌。目前临床上可用于治疗HCV感染的较有效药物也只有干扰素。
由于HCV基因的变异性较高（同源性在67％左右），其变异性被认为是感染复发率高的一个原因［13］，而其5′非编码区（5′noncodingregion，5′NCR）是高度保守的（92％～100％的同源性），因此抗HCV的ASON大部分是针对这一部位设计的．Wakita等［14］首先研究了ASON抗HCV的作用．他们针对HCV5′NCR的nt38～65，134～175，312～339合成了三段ASON，在一个无细胞蛋白质合成系统中，能有效抑制病毒蛋白的翻译，表明这些区域对HCVRNA的翻译是重要的，但由于缺乏一个很好的细胞模型，这些ASON在细胞内的作用仍不请楚．Mizutani等［15］发现一个嗜人T淋巴细胞病毒Ⅰ型（HTLV-1）感染的细胞系MT-2能支持HCV的复制．他们用MT-2的研究表明：针对HCVC基因含起始编码子的一段ASON（342～361）及其下游的一段序列（346～363）均能特异地抑制HCV的复制，而针对起始编码子上游的一段序列（321～340）则只有轻微的抑制作用．Alt［16］的实验也表明，针对HCV5′NCRnt326～348的硫代反义核酸，在体外能有效抑制受HCVRNA 5′NCR调控的报告基因荧光素酶的活性，当浓度为4.14μmol／L时，抑制率达96％．利用核酶抑制HCV的复制体外也进行了一些研究．Lieber等［17］针对HCV5′端的高度保守区设计了6个锤头型核酶，用重组的腺病毒载体进行表达，联合或单独应用能有效抑制CHO细胞中HCVRNA的表达．从慢性HCV感染者体内分离肝细胞进行培养，并转染含核酶的腺病毒载体，也能有效降低HCVRNA，而且对来自二个由不同基因型HCV感染的病人的肝细胞都是有效的。由于腺病毒载体表达的产物能够在体内直接到达肝脏，因此，这一研究为临床上利用核酶治疗HCV感染提供了新的希望．Welch等［18］则针对HCV5′非翻译区设计了4个发夹型核酶CR2、CR6、CR7、CR8，用HCV5′NCR的nt38～187这一片段作为底物，体外研究发现CR2能以时间依赖的方式切割底物，在作用2h，底物被切割32.2％，而当底物为HCV的nt38～698时，CR2在体外的切割活性就很低，除非底物在切割前预先进行变性，这可能是由于底物中存在二级结构，使核酶不能达到切割部位．通过设计一些能减少底物RNA二级结构的RNA分子，能使CR2的活性增强3～5倍。另外，他们还针对HCVRNA包被蛋白编码区设计了三个核酶，体外均能有效切割HCVnt38～698的底物RNA。随后，他们构建了这些核酶的真核表达载体，分别在HT1080和HeLa细胞中分析它们的切割活性，结果表明能有效抑制报告基因抗性克隆的产生，在未感染的HepG2和HT1080细胞中稳定表达核酶能阻止随后的HCV感染。这些结果表明抗HCV核酶在人中具有抑制HCV基因表达和感染的潜力，但核酶要应用到体内，仍需进行大量的研究。
3 反义核酸抗丁型肝炎病毒
丁型肝炎病毒（HDV）是一缺陷型单股环状负链RNA病毒，需HBV的辅助方可感染人体，其与HBV同时或重叠感染常导致肝炎慢性化或重型化。HDV是目前已知的唯一具有核酶活性的动物病毒，其基因链和抗基因链均具有自裂活性，核酶为假结样（pseudoknot-like）结构，在HDV复制过程中起着关键的作用［19］，这从理论上为利用ASON抑制核酶活性以阻断HDV复制提供了理论依据。用反义核酸阻断HDV感染在国外还未见报道。我们室和第三军医大学及302合作进行了这方面的工作。我们在进行了人HDV核酶活性区cDNA克隆及序列分析，并构建了含HDV核酶cDNA片段的质粒（PHDVrz227）的基础上，以HDV基因链核酶区具有重要作用的nt721～735位核苷酸为封闭靶序列，设计合成了15聚的ASON，发现在体外能有效抑制112nt核酶催化的自裂反应，并进一步对此ASON进行硫代修饰，观察其在HDV感染的树鼠树动物模型体内的作用，结果表明能较好地阻断树鼠树体内HDV的感染［20］。这些研究为深入进行ASON的抗丁型肝炎病毒作用及临床提供了重要依据。
综上所述，应用ASON技术抗肝炎病毒研究已取得了一些可喜的成绩，为进一步过度到临床应用奠定了基础。但由于该领域的研究毕竟刚起步不久，仍有许多问题亟待解决．ASON的修饰和导向仍是ASON治疗研究中的二个重要问题。核酶虽能特异性切割病毒RNA，但要达到理想的治疗目的还需改善其透膜性和稳定性。对HBV和HCV来说，如何从众多的作用部位中筛选出最佳的ASON序列仍需进行大量的研究工作。ASON在体内的抗病毒活性可利用的资料仍很有限，对它们在体内的药动学、药效学、毒副作用、抗病毒活性评价等仍需进行探讨，建立更多合适的动物模型也极为迫切。另外，ASON的大量制备及成本问题也是影响ASON推广应用的二个关键问题．尽管如此，ASON无疑为肝炎病毒的治疗带来了新的希望．相信不久的将来，这些问题都将得到解决，ASON将成为一种有效的抗肝炎病毒新药物。
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