害虫抗药性进化的遗传起源与分子机制

    摘 要　根据生物进化理论深入理解害虫抗药性进化的遗传起源，并根据解释基因新功能进化的基因重复理论，推测认为基因重复为抗性基因变异提供了原材料。最后，根据现有抗性报道的例子将抗性突变的分子机制进行归类，并发现在多样化的抗性突变中存在一定的性，如靶标位点的点突变导致抗性的机制是靶标抗性机制的主要形式，基因扩增或基因过表达导致的代谢酶活性增加是代谢抗性的重要机制，这种规律性与变异的适合度密切相关。 
　　关键词　害虫，抗药性，进化，起源，遗传，机制 
　　 
　　害虫对化学农药的抗性进化不到100年，就已经有500多种害虫对一种或多种杀虫剂产生了抗性。害虫抗药性的进化导致化学防治的失效，给农业产量造成很大的损失，例如据Palumbi估计，在美国每年由于害虫产生抗性导致的损失至少有30多亿美元，这其中包括由于抗性加大农药使用的额外消费以及抗性害虫对农产品的直接损失。 
　　早在1951年Dobzhansky就认为，杀虫剂抗性是一种进化现象。遗传分析可以有助于研究抗性机制和制订抗性治理策略，是研究抗性的一个主要工具。本文从遗传角度对抗性进化的本质进行探讨，并归纳分析抗性基因突变的主要类型，以期对害虫抗药性的进化的有更好的理解。 
　　 
　　1、害虫抗药性进化的遗传起源 
　　 
　　1.1　遗传变异是害虫抗药性进化的基础 
　　由于害虫对杀虫剂的抗性是生物进化的一个特例，可以从生物进化角度对害虫抗药性进化进行分析。生物进化的基础是生物遗传结构的不稳定性即遗传的相对保守性和变异的绝对性，这种变异的绝对性结合环境的复杂性造成了生物的多样性，给生物进化带来可能。诱导变异大致分2种情况，一种是生物在自身的遗传体系中发生的变异，这种变异具有普遍性；另一种是由外在的多样化的环境条件诱导的(包含辐射诱导、化学和物理诱导等)。 
　　在药剂选择前，害虫种群内存在着大量的变异，这其中就包括在历史进化过程中由于自身的繁殖发育而产生的遗传变异和由于外在的环境诱导的变异。这些变异是抗性进化选择的原料，故药剂首先作为抗性基因型的选择剂存在，这符合“前适应假说”的解释。最近一个研究报道很好地证明了这个假说，Hartley等研究表明在采自于杀虫剂应用前的澳大利亚羊绿蝇Lucilia cuprina品系中检测到对马拉硫磷的抗性。但这不是说药剂不会诱导抗性发生，若药剂长期作用，害虫种群肯定会慢慢适应进化出对应的变异，但这类变异的进化过程很漫长，远远不及药剂的选择作用快，故药剂普遍作为选择剂。药剂除了可能对遗传变异有诱导作用的可能之外，还有可能存在对抗性变异的促进作用，如杀虫剂可以促进基因扩增，从而促进抗性进化。 
　　通常变异是不利性，因为其干扰了在历史长河中进化而成的正常稳定的遗传结构。若无外在的定向选择作用，此变异会因随机性而以极低频率存在，甚至会被选择所淘汰。也就是说，只有当外在的选择对某种变异有定向的筛选作用时，此变异才呈定向性。所以说害虫抗药性的进化是定向选择，而不是定向变异的结果。 
　　遗传变异是害虫抗药性进化的基础，原始野生害虫种群中存在大量频率极低的变异等位基因，这些基因都是杀虫剂选择的原材料。杀虫剂选择是抗性进化的主要动力，即人类是进化的最大驱动力。因此被杀虫剂选择的变异基因的频率上升就是害虫抗药性进化的本质。 
　　 
　　1.2　基因重复为遗传变异提供了原材料。是抗性进化的主要根源 
　　突变是所有遗传变异最本质的起源，但是从短期来看，普遍认为基因重复是新基因功能的主要原材料。理论认为基因重复在初期阶段导致功能过剩，基因重复后，早期存在对保留原始功能的基因拷贝具有正向选择(positive selection)作用，即其它重复基因有可能会简单地通过退化突变(degenerative mutations)而成为沉默基因或无功能基因，因随机漂变而生存下来。又因为大部分突变对适合度是有害的，故所有模型预测这种无功能化(non－functionalization)是最常见的情况。极少数情况下，在一个基因拷贝保留原有的功能的基础上另一个拷贝可能接受了一个新的有益的功能，通过自然选择而被保持下来也即是新功能化(neofunctionalization)过程。虽然基因重复被进化成新功能的几率很罕见，但这些重复基因的随机沉默对新物种的被动起源进化起了明显作用。 
　　由于抗性进化是一种进化现象，基于以上理论，抗性基因变异的主要原料是基因重复，其进化实质是由原来的基因进化成具有新功能(表现为抗性相关)的基因。进一步推论，与抗性相关的变异基因在药剂选择前有2种存在可能，一种是抗性变异基因以沉默基因形式存在于害虫基因组中，即基因重复后这些无功能基因因随机漂变而生存下来。现研究证明了抗性基因家族中存在沉默基因，如冈比亚按蚊Anopheles gambiae的P450家族下的5个成员是假基因，GST家族的一个基因(GSTd6)也可能是无功能基因。又如研究证明无效等位基因met调控met基因的转录水平引起保幼激素(JH)受体基因met的产物完全消失导致保幼激素类似物(JHAs)抗性产生。另一种可能是抗性变异基因以功能基因形式寄存在害虫个体内随机存在，因变异基因大部分伴随着适合度的下降，其存在几率极低，也就是抗性等位基因初始频率很低。 
　　因此，药剂对抗性基因的选择作用也可以分成2种，一是在基因组中对抗性基因的选择作用，即有利于在药剂选择压力下生存的变异的无功能等位基因渐渐取代基因组中原始基因拷贝的主导地位的过程。另一种是对抗性基因型的选择作用，即对抗性基因的寄主——表现为抗性的害虫个体的筛选。由于害虫种群中随机存在着抗性个体，而且沉默基因取代原始基因的过程很慢，故一般情况下药剂直接对抗性基因型进行筛选。但是若从田间采集昆虫在室内进行抗性筛选时采集的试虫基数很小，很可能该昆虫群体中没有抗性变异的害虫个体来配合药剂的筛选，这种情况下对抗性基因的选择作用就有可能出现，但抗性上升速度很慢。 
　　 
　　2、害虫抗药性进化的分子机制 
　　 
　　由于基因重复后导致的功能过剩，重复基因由于不受功能上的限制，很可能会出现丰富多样的变异类型，所以说抗性基因变异机制很丰富。但在多样化的基因变异中，又有一定的规律性，如靶标位点的点突变导致抗性的机制是靶标抗性机制的主要形式，基因扩增或基因过表达导致的代谢酶上调是代谢抗性的重要机制。这种规律性是由在自然选择下对基因变异的随机选择作用和在药剂选择压下对更适应此环境的变异的定向选择作用共同导致的。这也说明抗性基因的变异机制的存在受到其本身所伴随的适合度代价(fitness cost)和对药剂选择压的适应能力的影响。 
　　从现有的害虫抗药性事例来归纳，抗性基因变异主要有以下3种机制。 
　　 
　　2.1　结构基因的变化(gene structure change) 
　　现有的害虫抗药性研究表明基因结构的变化机制主要是点突变(其中绝大部分是属于单个点突变)。 
　　2.1.1　点突变点突变有2种机制，一种是无义突变(nonsense mutation)，即某个核苷酸的突变导致了终止密码子(如ATT)的出现，使转录提前终止。例如昆虫对生物农药Bacillussphaericus(球形芽孢杆菌)的抗性机制就是无义突变。其抗性机制为编码毒素结合蛋白Cpm1蛋白的Cpm1基因发生点突变，导致翻译的提早终止，使Cpm1的疏水末端被切除，阻止了Cpm1蛋白与胞质膜的结合，使毒素的杀虫作用消失，但对毒素与Cpm1蛋白的结合没有影响。另外一个事例是Xu等报道由于一个提早终止密码子的出现导致一个钙粘素基因Ha-BtR的分裂与棉铃虫Helicorverpa armigera对Bt抗性紧密联系。 
　　另一种突变机制是错义突变(missense mutation)，即基因的编码区中的一个核苷酸被另一个不同的核苷酸取代，导致产生不同的氨基酸，使基因产物的三维结构发生变化而产生抗性。由于三维结构的改变而导致与其作用部位结合能力的降低或增加(靶标抗性机制)，或降低基因产物对杀虫剂的代谢能力(代谢抗性机制)。这种结构的改变并不改变产物的量，而是改变产物的质。大多数杀虫剂都是以一个关键蛋白作为靶标，现研究表明Ace.Nla.Rdl.para.met基因的点突变就可相应地导致杀虫剂靶标受体——昆虫体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱烟碱受体(nAChR)、γ－氨基丁酸(GABA)受体、钠通道、保幼激素(JH)受体的结构的变化，从而导致昆虫个体对相应的杀虫剂的靶标抗性产生。另外，也有研究表明代谢酶如酯酶的基因结构的改变，可导致基因产物代谢酶的质的变化，从而导致昆虫个体对相应的杀虫剂的代谢抗性产生或变化。 
　　靶标位点的点突变所造成的变异程度相对于其他变异机制而言是较弱的，这样的基因相对保守性既保证了虫体内在机能的正常运作足以使其存活下来，又使杀虫剂结合能力下降，从而表现出对杀虫剂的抗性。因此在以靶标机制作用的杀虫剂的选择压下，靶标位点的点突变更具有生存的优势。 
　　2.1.2　基因重组 一个品种中可能同时存在几个突变的组合，这样可导致更高水平的抗性产生。如Mutero等将在黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的不同抗性品系的Ace基因中发现的不同点突变的组织进行表达后发现，高水平的抗性可能是由不同点突变的组合所引起，这些点突变单独存在时只表达很低的抗性；Kozaki等也证明了Ace内的多点突变和基因内重组能使害虫的抗性明显增加。  　　基因重组增加了异常等位基因的数量和频率，因此对抗性基因进化有重要的影响。Mmem等认为种群中存在的抗性等位基因之间的重组是害虫迅速适应新的选择压的一个机制。几个点突变的重组可产生较高的抗性水平，但同时也造成了较大的适适合度代价。当有杀虫剂选择压时，单个突变可以通过重组形成产生较高的抗性杂合子的种群而生存下来，当无选择压时，有多个点突变的个体可以和敏感个体杂交而保存抗性突变，具有这种杂合子的种群也具有一定水平的抗性，最初表现出一定的杂种优势。但随着杀虫剂选择压消退，这种杂种优势也渐渐退化。 
　　2.1.3　移码突变——基因缺失与插入染色体的缺失具有很大的致死性，这对生物个体的生存非常不利。目前在抗药性基因的研究中也发现抗性基因或基因片段的缺失机制。如Morin等报道抗Bt棉红铃虫Pectinophora gossypiella品系的3个钙粘素突变等位基因都发生了氨基酸的片段缺失；苏建亚报道棉铃虫抗性品系对Bt棉高水平抗性是由于钙粘素基因发生了大片段缺失突变所至。Gahan等报道的因反转座子介导的序列插入导致钙粘素基因家族的一个基因的突变是一种基因序列的插入机制。 
　　由于移码突变相对于错义突变而言，其变异程度较大，并伴随较大的适合度代价，故在药剂选择前这些突变的存在几率就相对较低，而且药剂选择后对生物个体的生存也不利，因此发现移码突变的抗性机制的事例不是很多。 
　　 
　　2.2　基因扩增 
　　基因扩增是生物对环境有害化学物质产生抗性的一种基本而普遍的机制。一个基因扩增的结果是在DNA中呈现该基因的许多拷贝。基因扩增和基因表达的改变导致基因产物的过表达是代谢抗性的主要机制。 
　　对于酯酶介导的抗性，基因扩增是酯酶过表达引起抗性的主要机制。例如这些酶的产物过量在桃蚜Myzus persieae，库蚊Culicine mosquitoes以及褐飞虱等昆虫体内被证实。 
　　然而，大部分抗性品系P450s过表达的事例不是由基因扩增引起，但Nikou等报道通过southern印迹分析法，发现基因扩增是菊酯抗性按蚊A.gambiae品系的CYP621基因过表达的一个原因。 
　　另外，目前尚未发现GST酶系的基因扩增与杀虫剂抗性有关。这表明在GSTs引起的抗性中，若不是全部但至少是大部分事例似乎与基因扩增无关。 
　　基因扩增的机制可能有转座子(transposable element)或可移动因子(mobileelement)的作用、跳远式重复(saltatoryreplication)、无插入序列的头尾连接式(hcad-to-tail tandem fashion)排列方式、姐妹染色体间的随机不平等交换(random unequal cross-over)以及基因重复后误排导致串联重复(tandem repeat)等机制。 
　　在代谢抗性中，解毒酶的量变更有利于害虫在维持虫体的生存的基础上对毒物的不利作用的抵抗。由于中等水平的基因扩增的变异速率较高且其多效性适合度下降(Dleiotropiefitness cost)较弱，基因扩增机制在代谢酶的上调节中很普遍。 
　　 
　　2.3　基因表达的改变 
　　这类机制在与抗性相关的GSTs和P450单加氧酶系中已被证实，但是虽然基因调节可以解释酯酶A1的产物过量，可尚未在酯酶介导的代谢抗性中发现。 
　　基于GSTs的抗性的分子基础已在家蝇Musca domestica及蚊类昆虫A.gambiae和Aedesaegypti中很好地被研究。在所有的事例中，抗性昆虫的GS％上调节是由于反式上调作用引起；而在P450s的转录调节中，顺式或反式作用都有可能。 
　　目前，许多事例研究发现了抗性品系的P450s过量表达，例如，抗DDT果蝇D.melanogaster品系的CYP6A2和CYP6G1基因的过表达、抗二嗪磷家蝇肘，domestica品系的CYP6A1基因过表达、抗菊酯棉铃虫(H.armigera)的CYP687基因过表达、抗菊酯库蚊品系的CYP6E1基因过表达、抗菊酯按蚊A.gambiae品系的CYP621基因过表达，以及抗溴氰菊酯库蚊C.PiPiens pallens品系的CYP6F1基因过表达等。 
　　当药剂直接以毒物形式作用于虫体时，解毒酶的上调节导致抗性增加；而当药剂作为前体杀虫剂应用即须先被代谢成毒物，代谢酶的下调节将增加抗性。这种机制有许多事例，但分子机制尚不祥。例如，在Bt抗性中，就可以通过蛋白酶下调引起Cry毒素的活性下降从而导致抗性。 
　　在靶标抗性中也有关于基因表达的改变导致的抗性机制的报道，如钠离子通道的para基因的反式下调作用(trans-down-regulation)机制。 
　　另外，Wilson和Ashok试验证明JH受体基因met的产物完全消失(也就是基因沉默现象)导致抗性产生，并证明了是由无效等位基因met调控met基因的转录水平引起的。JH受体蛋白不是个体生存所必需的，也就是说编码JH受体蛋白的基因是无效基因(null gene)，分子分析已证明JH抗性基因met是无效基因。因这些无效基因的缺失或沉默导致受体蛋白的消失或其功能消失从而能使抗性产生，而且适合度下降的程度也不会很大。假如这种推测被验证是正确的，那么无效基因的变异就拓宽了抗性基因变异范围，使害虫对杀虫剂选择压的适应范围加大。 
　　另外，小幅度的缺失、插入和调控元件的转座可能会扰乱基因表达的空间和时间形态，从而导致抗性。 
　　虽然基因表达的调控方式多样，但是代谢酶的上调机制在代谢抗性中很普遍。 
　　本文在生物进化理论的基础上分析了害虫抗药性进化的遗传本质，在现有的研究结果的基础上了害虫抗药性的分子基础，这将有助于理解抗性进化的基础，而且对抗性研究以及抗性治理与预防工作有很好的理论指导意义。 
　　随着一些昆虫(例如家蝇Drosophila和按蚊Anopheles)的基因组全序列被克隆及分析，杀虫剂抗性的研究进入基因组时代，抗性的分子基础将会被更好的理解。特别是在酯酶，细胞色素P450酶系和谷胱甘肽转移酶等多基因家族的基因成员控制的抗性研究中，基因组途径将是一个很有前景的研究方法。