人参、甘草诱导PBMC分泌细胞因子和SIL-2R的作用及机制探讨

        作者：张剑平，徐克沂，高燕菁，樊文梅，魏红山，徐道振，陆蕴茹

【摘要】  目的  探讨人参、甘草体外诱导人外周血单个核细胞（PBMC）分泌细胞因子机制。方法  我们选择生晒参、红参、甘草三种中药的提取液加入PBMC培养液中，孵育5d后，采用ELISA方法测定上清液中的细胞因子水平。结果  生晒参、红参、甘草能诱导PBMC分泌细胞因子和SIL-2R，其中药组TNF-α、SIL-2R、IL-2、IFN-γ含量明显高于细胞对照组，特别是生晒参诱生PBMC高分泌IFN-γ尤为突出。结论  生晒参、红参、甘草对体外诱导PBMC分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ细胞因子和SIL-2R。

    【关键词】  生晒参  红参  甘草  PBMC  细胞因子

Studies on the role of induced cytokines，SIL-2 by ginseng and glycyrrhiza in PBMC

        【Abstract】  Objective  In order to elucidate the role of ginseng and glycyrrhiza in cellular immunity regulation and study the mechanism of induced cytokines by the Chinese medicines in vitro.Methods  PBMC were induced by water-solubility extract respectively from radix ginseng，radix ginseng rubra and glycyrrhiza， and cytokines levels was assayed by the methods of ELISA.Results  Radix ginseng，radix ginseng rubra and glycyrrhiza could induce high levels of cytokines. The levels of TNF-α，SIL-2R，IL-2 and IFN-γ among the group of Chinese medicine were significant higher than that of control group， especially high-level production of IFN-γ induced by radix ginseng.Conclusion  Radix ginseng，radix ginseng rubra and glycyrrhiza play a role of positive regulation for immunity system in vitro as immunopotentiator. Radix ginseng was stronger than the radix ginseng rubra and glycyrrhiza， but they have a different mechanism of immune regulation.

    【Key words】  radix ginseng  radix ginseng rubra  glycyrrhiza  PBMC  cytokines

    近年来有关人参、甘草调节免疫功能的研究已有许多报道［1］，但对其体外诱导PBMC分泌细胞因子和SIL-2R很少报道。本实验人参、甘草诱导外周血单个核细胞的细胞因子和SIL-2R分泌的调节作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料
   
    1.1.1  生晒参、红参、甘草标准品  购自药品生物制品检定所。

    1.1.2   诱生细胞  本院职工健康献血员。

    1.1.3  TNF-α检测试剂  美国Genzyme公司。

    1.1.4  淋巴细胞分离液  中国医学院天津血液病研究所。

    1.1.5  IMDM营养液  美国GIBCO公司。

    1.1.6  IL-2（白细胞介素Ⅱ）检测试剂盒  美国Biosos公司。

    1.1.7  IFN-γ（干扰素-γ）检测试剂盒  美国Biosos公司。

    1.1.8  SIL-2R检测试剂盒  白求恩医科大学免疫教研室。

    1.2  方法

    1.2.1  中药制备  取生晒参、红参、甘草标准品各5g，分别加入双蒸水50ml，浸泡24h，加热回流2h，用中性滤纸过滤，置4℃冰箱沉降24h。4℃ 14000rpm离心10min，弃沉淀物，将上清液除菌，分装，4℃保存备用。

    1.2.2  分离PBMC  取肝素抗凝血50ml，用无Ca2+，Mg2+，Hank’s液将抗凝血1：1稀释后，缓慢加在淋巴细胞分离液上，抗凝血与无Ca2+，Mg2+，Hank’s液和淋巴细胞分离液的比例为1：1：1， 1700rpm离心20min，吸取淋巴细胞层，加入无Ca2+、Mg2+，Hank’s液混匀洗涤，1300rpm离心10min，弃上清，重复洗涤2次。进行细胞计数后，备用。

    1.2.3  细胞因子诱生  以细胞浓度2.5×106/孔置入24孔细胞培养板，实验组分别加入用IMDM营养液按一定比例稀释的生晒参、红参和甘草无菌溶液，对照组分别加入等量IMDM营养液，37℃、5%CO2孵育5d，分别取出培养上清，2000rpm离心10min，弃沉淀物，待检测。

    1.2.4  细胞因子测定  严格按说明书操作测定细胞培养上清中细胞因子水平和SIL-2R。

    1.2.5  统计学方法  应用t检验。

    2  结果

    生晒参、红参及甘草在没有任何诱生剂参与的情况下，体外诱导PBMC产生细胞因子，结果显示对照组的TNF-α、SIL-2R、IL-2、IFN-γ效价明显比实验组低，而生晒参诱导的PBMC上清液中IFN-γ水平又明显高于红参组，P<0.01，差异有高度显著性。见图1。

图1

    3  讨论

    研究表明人参是一种正向免疫调节剂［2］。近年来国内外对人参、甘草的研究主要集中在药源开发、提取新的有效成分及药理药效方面的研究。研究中发现人参不仅可协同PHA对PBMC促诱生IFN-γ，而且还可增进IFN-γ基因表达，促使IFN-γ mRNA转录量增加及高分泌IFN-γ［3，4］。

    以往对人参、甘草的免疫药研究多侧重于体内观察及动物实验，尚未见到在体外实验中直接作用于PBMC并诱导分泌TNF-α、SIL-2R、IL-2、IFN-α的研究报道。淋巴细胞是机体免疫应答的核心，而淋巴细胞分泌的TNF-α、SIL-2R、IL-2、IFN-α等多种细胞因子，又是T淋巴细胞的活化指标。IL-2是一种由TH细胞分泌的具有显著调节免疫应答作用的介质，能活化巨噬细胞，增强NK细胞和LAK细胞活性，诱生IFN，及激活B细胞产生抗体等生物效应，因此许多学者主张以细胞因子水平来研究免疫功能具有关键意义。本实验在没有任何诱生剂参与的情况下，生晒参和红参及甘草都能诱导高效价的细胞因子，表明

    人参和甘草均具有重要免疫调节作用。特别是生晒参诱生PBMC高分泌IFN-γ尤为突出。并能提高单位细胞中各类因子产量的作用［5］，进而通过IL-2广谱的免疫增强作用，改善或提高机体的免疫功能。再一次证明了红参和生晒参

    及其有效成份能够增加人的特异性与非特异性细胞免疫功能［6］。说明生晒参及红参和甘草均具有明显促进淋巴细胞活化以及促进内源性IL-2 、IFN-γ的产生，但体外诱导细胞因子水平不完全相同。其结果表明这些细胞因子是生晒参、红参及甘草发挥药效的分子介质和物质基础，是其适应原样作用，也是增强机体对各种有害因素的非特异性抵抗力的药效机理之一。也可能中药进入体内后对不同的免疫应答可有不同的作用，这种选择性作用的现象进一步反应了中药免疫药理学作用的精细性与复杂性。甘草的作用机理及药理药效等方面仍然是今后研究的重点。

    【】

    1  尹旭辉，杨晓临，姜在福，等. 甘草酸单胺对寒冷过程中小鼠脾细胞NK活性及IL-2产生能力的调节作用. 解放军预防医学杂志，1993，11（5）：382-383.
    2  罗晶，郭焱，勾敏慧，等.人参养荣汤对小鼠免疫功能的调节.医学杂志，2002，5：250.
    3  田志刚，扬贵贞. 人参三醇皂甙促进人淋巴细胞IFN-γ基因表达. 上海免疫学杂志，1991，11（2）：82.
    4  常雅萍，扬贵贞. 几种中药提取物诱生人干扰素. 中国实验临床免疫学杂志，1992，29（2）：37.
    5  扬吉成，盛伟华，张云，等.羧甲基茯苓多糖对HPBL分泌IL-2、TNF、IL-6、IFN-γ的调节作用.中国免疫学杂志，1997，13（5）：293.