苯磺酸氨氯地平片在健康人体的药动学及生物等效性评价

                                               作者：张琰，杨蕾，刘梅，覃华，陈笑艳，张逸凡，钟大放

【关键词】  苯磺酸氨氯

　　Assessment of pharmacokinetics and bioequivalence of amlodipine besylate in healthy volunteers

　　【Abstract】 AIM: To study the pharmacokinetics parameters and bioavailability of amlodipine besylate tablets. METHODS:  An open, randomized and twoperiod crossover study with a twoweek washout interval was performed in 18 healthy volunteers. Concentrations of amlodipine besylate in plasma were assayed by liquid chromatographicmassmass spectrometric method after a single oral dose of 10 mg of the tested or the referenced tablets. The pharmacokinetics parameters, AUC, Tmax and Cmax were analyzed by two oneside t test and (12α) 90%. RESULTS:  The main pharmacokinetics of the tested and referenced tablets were: Tmax: (8.9±2.5) and (8.2±2.2)  h; Cmax: (5.1±2.3) and (5.0±2.2) g/L; T1/2: (45±10) and (48±24) h; AUC（0-120 h）: (191±69) and (196±53) μg/（L・h）. The relative bioavailiability of amlodipine besylate was (99±23)%. CONCLUSION:  The results of the statistical analysis show that the two formulations are bioequivalent.

　　【Keywords】 amlodipine besylate;  pharmacokinetics;  biological availability; liquid chromatography; spectrum analysis, mass

　　【摘要】  目的： 研究苯磺酸氨氯地平片在健康人体的药代动力学特征及其生物等效性评价. 方法： 18名健康志愿受试者，口服苯磺酸氨氯地平试验品和参比品10 mg，用标准二阶段交叉设计自身对照试验方法，以液相色谱质谱质谱联用法测定服药后120 h内不同时刻的血药浓度，主要药动学参数，并采用方差分析和双单侧t检验（12α）90%置信区间进行生物等效性评价. 结果： 受试者分别口服受试品和参比品后，其主要药动学参数Tmax, Cmax, t1/2和AUC（0-120 h）分别为： （8.9±2.5）和（8.2±2.2） h；（5.1±2.3）和（5.0±2.2）  μg/L；（45±10）和（48±24）  h；（191±69）和（196±53）  μg/(L・h). 受试品的相对生物利用度为 (99±23)%. 结论： 结果表明，两种制剂具有生物等效性.
 
　　【关键词】 苯磺酸氨氯地平片；药代动力学；生物利用度；液相色谱；光谱分析，质量

　　0引言
  
　　苯磺酸氨氯地平片（Amlodipine besylate），临床上主要用于高血压和心绞痛的［1］. 与同类型的其他药物相比，该药有服药量低、药效维持时间长等特点. 由于氨氯地平的血药浓度低，我们采用精确度和灵敏度更高的液相质谱联用法测定血浆中氨氯地平浓度.为确保用药质量，我们评价苯磺酸氨氯地平在人体内的生物效应，并对苯磺酸氨氯地平片和络活喜片在健康志愿者体内的药物代谢动力学和生物等效度进行了比较，旨在为临床合理用药［2-5］提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1仪器TSQ型液相色谱质谱质谱联用仪，配有大气压化学电离源（APCI源）以及Xcalibur 1.4数据处理系统，Surveyor输液泵（美国Finnigan公司）. 色谱柱ZorbaxXBDC18柱，5 μm粒径，150×4.6 mmI.D（美国Agilent公司）.

　1.1.2药品和试剂受试制剂： 苯磺酸氨氯地平片（陕西正康医药化工有限公司，批号 20030819， 5 mg/片）；参比制剂： 络活喜片(辉瑞制药有限公司生产，批号 45805012， 5 mg/片)；苯磺酸氨氯地平对照品（宁波大红鹰药业，含量>99.0%）；内标为盐酸苯海拉明（药品生物制品检定所，含量>99.4%）；甲酸（分析纯，天津市博迪化工有限公司）和乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；二氯甲烷和乙醚（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；磷酸钠（分析纯，沈阳化学试剂厂）；空白人血浆（沈阳中心血站）.

　　1.1.3色谱条件流动相为乙腈水甲酸（80∶20∶0.5, V/V/V）,流速为 0.5 mL/min,柱温为室温.

　　1.1.4质谱条件检测方式为正离子检测，离子源为APCI源；电晕放电电流4.0 μA；加热毛细管温度为280℃；气化室温度450℃；鞘气（N2）压力30 Arb；辅助气（N2）流量3 Arb；碰撞气（Ar）压力1.5 mTorr；碰撞诱导解离（CID）电压分别为15 eV（氨氯地平）和25 eV（苯海拉明）；扫描方式为选择反应监测（SRM），用于定量分析的离子反应分别为 m/z 409→m/z 238（氨氯地平）和m/z 256→m/z 167（内标苯海拉明）；扫描时间为0.3 s.

　　1.2方法

　　1.2.1研究对象与给药方案以标准二阶段交叉自身实验法，将18名健康男性志愿者随机分为两组. 试验第一阶段第一组口服受试制剂10 mg，第二组口服参比制剂10 mg. 经2 wk清洗期后，两组交换服药品种进行第二阶段试验. 受试者于每次试验前日20：00开始禁食，于试验当日07：00空腹按规定的剂量及方法给药，服药后4 h 和10 h进食统一标准午餐.服药前抽取空白血样4 mL，服药后2， 4， 6， 8， 10， 14， 24， 36， 48， 72， 96和120 h采集静脉血4 mL, 立即移入经肝素处理的试管中离心10 min,分离血浆,置于无菌干燥塑料管中, 于-20℃冰箱保存待测. 由于氨氯地平对光不稳定,因而采血过程避光操作，血浆样品均避光保存.

　　1.2.2血浆样品的处理与测定取血浆1.0 mL,加甲醇水（50∶50， V/V）100 μL,内标溶液（200 μg/L盐酸苯海拉明）100 μL，磷酸钠缓冲液（10 mmol/L,  pH 12）500  μL,混匀；加提取试剂乙醚二氯甲烷（2∶1， v/v）3.0 mL,涡流1 min,往复振荡10 min, 离心5 min,取上层有机相于40℃空气流下吹干，残留物于100 μL流动相中溶解，取20 μL进行LC/MS/MS 分析.

　　1.2.3标准曲线的制备取空白血浆1.0 mL，加氨氯地平标准系列溶液100 μL，配制成相当于浓度为0.2， 0.5， 1.6， 4.0， 8.0和16.0 μg/L的血浆样品，每种浓度做两份样品，按1.2.2操作，记录各色谱峰的峰面积. 以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法［6］进行回归运算，求得标准曲线回归方程，氨氯地平的线性范围为0.2~16.0 μg/L.

　　1.2.4方法的精密度与准确度取空白血浆加入适量氨氯地平标准溶液，分别配制成0.2， 4.0， 16.0 μg/L的低、中、高三个浓度的质量控制（QC）样品各两份，在1日内测3次，并以同法配制浓度连续测定3 d，1次/d，并与标准曲线同时进行，与配制溶液对照，求得本法的日内精密度和日间精密度.

　　1.2.5提取回收率取空白血浆3份，加入适量氨氯地平标准溶液，分别配制成0.2， 4.0， 16.0 μg/L的低、中、高3个浓度的样品，按样品测定法各测定含量6次，３种浓度下样品的提取回收率分别为： 84.0%， 77.2% 和81.2%.

　　1.2.6稳定性试验［7-8］报道，氨氯地平血浆样品-20℃避光放置6 mo稳定，日照4 h，即有30%以上的分解产物. 所以，全部试验过程均要求避光操作. 本试验考察了经液液萃取处理后的氨氯地平血浆样品室温放置24 h以及血浆样品经历3 次冷冻解冻循环的稳定性. 每一种储存条件的稳定性考察时，取空白血浆1.0 mL，配制氨氯地平低、高两浓度的血浆样品，每一浓度进行三样本分析，采用LC/MS/MS法测定，结果表明处理后的氨氯地平血浆样品室温放置24 h稳定（RE为±6.3%）；经过3次冷冻解冻循环后稳定（RE为±12.7%）.
   
　　统计学处理:  Tmax, Cmax采用实测值，以消除相血药浓度对数与对应点时间的线性进行回归求算苯磺酸氨氯地平的体内消除半衰期，采用梯形法AUC（0-120 h）和AUC(0-∞)， 得到两制剂的主要药代动力学参数.  将AUC和Cmax参数进行对数转换后，以双单侧t检验和（12α）%置信区间法评价两种苯磺酸氨氯地平制剂在人体内的相对生物等效性.

　　2结果

　　2.1方法的专属性色谱图见图1. 在本试验所采用的色谱质谱条件下，氨氯地平和内标的保留时间为2.67, 2.70 min,氨氯地平和内标的峰形良好，无杂质干扰，基线平稳，可确保分析的专一性.

　　2.2方法的日内、日间精密度见表1.表1血中苯磺酸氨氯地平测定方法的日内、日间精密度(略)

　　2.3药代动力学Tmax, Cmax采用实测值，以消除相血药浓度对数与对应点时间的线性回归求算苯磺酸氨氯地平的体内消除半衰期，采用梯形法计算AUC（0-120 h）,  AUC(0-∞), 所得的两制剂的主要药代动力学参数见表2.表2分别口服苯磺酸氨氯地平两制剂（10 mg）后的药代动力学参数比较(略)

　　2.4生物等效性的评价 两种制剂中氨氯地平的AUC（0-120 h）, Cmax, Tmax和T1/2  ke无差异(表3). 进一步采用双单侧t检验和（12α）置信区间法分析，AUC（0-120 h）, AUC(0-∞), Cmax均拒绝不等效假设(P<0.05，表4). 两种分析方法表明，两种制剂具有生物等效性.表318名受试者口服苯磺酸氨氯地平两制剂后氨氯地平主要药代动力学参数方差分析结果（略）表418名受试者口服苯磺酸氨氯地平两制剂后氨氯地平主要药代动力学参数双单侧t检验（12α）90%置信区间检验结果（略）

　　3讨论

　　国内外关于氨氯地平含量测定的方法多采用HPLCUV，但其灵敏度较低，而本研究采用的液相色谱质谱联用法检测的线性范围达到0.2~16.0 μg/L. 其具有高度的检验灵敏性，操作简便，可确保测定血浆中的微量氨氯地平浓度的准确性和可靠性.在流动相的选择上，选用乙腈水甲酸，甲酸为有机酸，可增加氨氯地平的溶解.

　　从氨氯地平血药浓度的测定结果可见，18例受试者服用受试制剂和参比制剂后，两组之间各参数间均无显著性差异，说明两种苯磺酸氨氯地平片在18例健康受试者体内的处置情况较为相似.
 从两种苯磺酸氨氯地平片的生物等效性分析结果可见，两种苯磺酸氨氯地平片的Tmax（实测值）、Cmax（实测值）和以梯形法求得的AUC（0-120 h）间的配对双单侧t检验和采用（12α）置信区间法分析，结果均表明，两种苯磺酸氨氯地平片在人体内具有生物等效性，受试制剂相对于参比制剂的相对生物利用度为（98.6±23.3）%，两种制剂在人体内具有生物等效性.

　　【文献】

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　　［2］　文爱东，黄熙，蒋永培，等. 心力衰竭对地高辛药动学的影响［Ｊ］. 第四军医大学学报，2001,22(7):631-634. ［3］ 赵磊，文爱东，蒋永培，等. 吉非罗齐胶囊在健康志愿者中的生物等效性评价［J］. 第四军医大学学报，2001,22(18):1689-1691.

　　［4］ 文爱东，赵磊，张三奇，等. 阿莫西林胶囊人体药代动力学及生物等效性评价［J］. 第四军医大学学报，2001,22(19):1805-1808.

　　［5］ 王萌，文爱东，赵磊，等. 盐酸曲马多片人体药代动力学和生物等效性［J］. 第四军医大学学报，2003,24(20):1902-1904.

　　［6］ 钟大放. 以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题［J］. 药物分析杂志,1996,16(5):343-346.

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　　［8］　陈笑艳，栾燕，钟大放，等. 液相色谱质谱质谱联用法测定人血浆中氨氯地平［J］. 药学学报，2001,36(1):51-54.