鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒构建及表达

                     作者：胡权,张正茂,张小勇,张振华,雷延昌,周敦金,黄建国,杨东亮

【摘要】  目的 构建鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染性克隆，通过体外细胞转染获得单一来源、基因序列清楚的体内实验的感染毒种。方法 以湖北麻鸭DHBV分离株（DQ276978）为模板，用PCR法从该DHBV全基因组克隆质粒（pMD-DHBV）和DHBV阳性血清中获取3部分基因片段，总长4?4kb，克隆至载体PCR2?1的SacI和NotI酶切位点，构建含1?5倍鸭乙型肝炎病毒全基因的重组质粒，并酶切鉴定其插入方向。将构建的重组质粒经脂质体LipofectineTM 2000导入鸡肝癌细胞系(LMH)细胞中转染表达，收集纯化后的转染细胞培养上清液作为体内实验感染的标准毒种。结果 PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定，证实成功获得正向插入的1.5倍鸭乙型肝炎病毒全基因重组质粒PCR2.1-DHBV1.5。Southernblot检测表明，该重组质粒在LMH细胞内存在各种病毒复制中间体；通过电镜观察，转染细胞上清液中存在DHBV完整病毒颗粒。结论 经体外重组，构建出携带1.5倍加长DHBV基因组片段的重组质粒PCR2?1-DHBV1?5，并可在鸡肝癌细胞LMH中介导高水平病毒复制，从而获得含可自我复制病毒颗粒的转染细胞上清液作为动物体内感染接种物。

【关键词】  鸭乙型肝炎病毒

　　鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与人类乙型肝炎病毒（HBV）同属嗜肝DNA病毒科，它们在形态结构、基因序列、病毒复制、致病机制及感染宿主等方面均较为相似，DHBV感染鸭模型使人们认识了嗜肝病毒的复制周期以及病毒持续存在和病毒彻底清除的机制。我们在对湖北麻鸭DHBV感染率调查的基础上，选择对DHBV易感且取材方便的湖北麻鸭作为实验鸭种，并分离出1株DHBV新毒株（DQ276978）〔1〕。进而以该毒株为模板，构建了1?5倍DHBV全基因重组质粒，通过该质粒在鸡肝癌细胞系(LMH)中稳定转染表达出含有可自我复制的病毒颗粒的细胞培养上清液作为单一来源、基因序列清楚的实验毒种，以期建立标准化的湖北麻鸭乙型肝炎病毒体内模型。另外，将该DHBV重组质粒与不同剂量人类载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽3G(APOBEC3G)真核表达质粒共转染LMH细胞，通过抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。

　　1  材料与方法

　　1?1  材料

　　1?1?1  质粒  pMD-DHBV为本实验室构建的含有湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA全长基因组的质粒；pSP65-DHBV16为双拷贝头尾相接的全基因DHBV DNA重组质粒，该克隆质粒(美国 Mandart 教授馈赠)；APOBEC3G真核表达质粒为本实验室构建保存；PCR2?1载体(美国Invitrogen公司)。

　　1?1?2  DHBV阳性血清  取自扩增出DHBV DNA全长基因组（DQ276978）的阳性血清。

　　1?1?3  细胞  禽类鸡肝癌细胞系LMH，为本室传代保存。

　　1?1?4  工具酶  LA Taq酶、限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sac I、Kpn I、Not I及凝胶回收试剂盒(大连 TAKARA公司)；Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)；T4DNA连接酶(美国GIBICO公司)。

　　1?1?5  生化及其它试剂  地高辛(DIG)标记及检测试剂盒(德国Roche公司)；Waymouth 细胞培养基(美国Sigma公司)；LipofectineTM2000(美国Invitrogen公司)。DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒(德国QIAGEN公司)；质粒提取试剂盒和动物培养细胞基因组DNA纯化试剂盒(大连TaKR公司)。

　　1?2  方法  通过对湖北麻鸭（DQ276978）DHBV DNA的全长克隆质粒的序列限制酶切图谱分析〔1〕，已明确其基因组的结构及与复制相关的重要元件的序列位置，在此基础上运用3片法构建出能自我复制的重组质粒。

　　1?2?1  构建质粒PCR 2?1-DHBV1?5  用EcoRI和BamHI双酶切pMD-DHBV，得到目的片段DA（DHBV3024/0nt-1473nt）；设计引物DB1/DB2和DC1/DC2分别经PCR扩增DHBV阳性血清获得目的片段DB（1473nt-2870nt）和DC（1395-3024/0nt）。将上述3片段插入PCR2?1的相应酶切位点后即得到1?5倍DHBV全基因重组质粒PCR2?1-DHBV1?5。

　　1?2?2  PCR鉴定  引物Ps1/Ps2和Pc1/Pc2为DHBV基因S区和C区的高度保守序列段，引物序列如下：Ps1（1318F）5′-TGGCCTAATCGGATTACTGG-3′，Ps2（1739R）5′-CAGCGTGGCTAATTGAGTTA-3′；Pc1（187F）5′-GCAATCACTAGACCAATCCA-3′，Pc2（397R）5′-GAGATCTATGGTGGCTGCTC-3′。PCR反应液组成：10×Buffer5μl;MgCl2（25mmol/L）3μl;dNTP（10mmol/L）1μl;Ps1/Ps2或Pc1/Pc2各1μl；Taq酶1μl；DHBV模板5μl；加灭菌纯水至50μl。PCR循环参数：94℃5min；94℃50s,61℃45s,72℃50s,40个循环；72℃10min。

　　1?2?3  酶切鉴定  用BamHI，SacI和EcoR I，Not I和EcoRI，Sac I和BamH I分别进行酶切鉴定。

　　1?2?4  序列测定  取一株阳性克隆质粒送上海生物工程技术服务公司测序。

　　1?2?5  脂质体LipofectineTM2000介导的DNA转染  在LMH细胞达到80%～90%融合时进行转染，设未转染LMH细胞对照和pSP65-DHBV16质粒对照。

　　1?2?6  蛋白印迹(Southern Blot)分析  提取转染LMH细胞内总DNA后，用DIG标记的DHBV全长基因组探针杂交，X-ray胶片发光显影。

　　1?2?7  转染细胞上清液中病毒颗粒电镜观察  收集转染细胞的上清液，离心后用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解沉淀，将该沉淀溶解物通过磷钨酸负染法进行电镜观察。

　　1?2?8  APOBEC3G真核表达质粒对DHBV的抑制效应实验  质粒PCR2?1-DHBV1?5分别与不同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA通过LipofectamineTM2000共同转染LMH细胞，72h后收集细胞。

　　2  结果

　　2?1  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的PCR鉴定  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5经不同引物C1/C2、S1/S2、DB1/DB2和DC1/DC2扩增后可产生依次为211，452，1 430和1 600的目的片段（图1）。

　　2?2  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的酶切鉴定  未酶切的重组质粒PCR2?1-DHBV1?5为8?4kb；用SacI和EcoRI双酶切该重组质粒可产生2?9和5?5kb的片段；该重组质粒经BamHI限制性内切酶消化后产生3?1和5?3kb的目的片段；用NotI和EcoRI双酶切PCR2?1-DHBV1?5可产生1?6和6?8kb的片段；用SacI和BamHI限制性内切酶消化该重组质粒后则产生1?6和6?8kb的目的片段。上述酶切结果均与预期相符（图2）。

　　2?3  转染细胞上清液中DHBV病毒颗粒的检测  在转染细胞上清液中检出大量直径为30～65nm的球形颗粒，其中一种为大小较均一，直径为40～50nm的实心病毒，有核心和球形包膜，即完整病毒颗粒；另一种是直径为30～65nm的类球形空心病毒，中央凹陷，未见丝状、管状体，即病毒表面抗原颗粒（图3）。

　　2?4  转染细胞内DHBV DNA的检测  分别将pSP65-DHBV16和PCR2?1-DHBV1?5转染LMH细胞，72h后收集细胞，提取DNA进行Southernblot检测。结果显示，重组质粒PCR2?1-DHBV1?5与双拷贝DHBV全长基因组质粒pSP65-DHBV16一样，均在转染细胞中检出大量DHBV DNA复制中间体（图4）。

　　M：DL2000 Marker;1：primer C1/C2;2：primer S1/S2;3：primer DB1/DB2；4：primer DC1/DC2

　　图1  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5的PCR鉴定（略）
 
　　M1：1Kb Marker;1：PCR2.1-DHBV1.5；2：PCR2.1-DHBV1.5/SarI+EcoR I;3：PCR2.1-DHBV1.5/BamH I;4：PCR2.1-DHBV1.5/Not I+EcoR I;5：PCR2.1-DHBV1.5V/Sac I+BamH I;M2：500bp Lad der  

　　图2  重组质粒PCP2.1-DHBV1.5的酶切鉴定（略）

　　2?5  APOBEC3G对DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5分别与不同剂量（20和40μg）的APOBEC3G真核表达质粒pXF3G-HA共同转染LMH细胞，转染后Southern blot检测细胞内的DHBV核衣壳相关DNA的结果显示，APOBEC3G对转染细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应（图5）。

　　图3  重组质粒PCR2?1-DHBV1?5转染细胞上清液(×60000)（略）

　　1：pSP65-DHBV16;2:PCR2.1-DHBV1.5;RC：松弛环状DNA；L：线性DNA；SS：单链DNA

　　图4  Southern blot 检测转细胞内DBBV复制水平（略）

　　PCR2?1-DHBV1.5(μg)    20  20  20

　　pX F3G-HA (μg)    -  20  40

　　pXF3H(μg)    40  20  -

　　pXF3H：真核表达载体；   

　　pXF3H-HA：APOBEC3G真核表达质粒 

　　图5  APOBE3G对细胞内DHBV核衣壳相关DNA水平的抑制（略）

　　3  讨论

　　在HBV己证实，构建1?3倍加长或头尾相接双拷贝的基因组，可以产生所有HBV转录子，并启动HBV的复制〔2〕。土拔鼠肝炎病毒(WHV)研究也有类似的结果〔3〕。LMH是DHBV稳定表达细胞系〔4，5〕，它能支持DHBV克隆病毒的复制，并能分泌完整病毒颗粒。本实验通过对湖北麻鸭DHBV分离株(DQ276978)的DNA全长基因组核苷酸水平和氨基酸水平的序列分析研究〔1〕，成功构建了1?5倍加长DHBV基因组重组质粒，经PCR鉴定、酶切鉴定以及序列测定均证明所构建的重组体与预期相符，包含能高效自我启动DHBV复制的全部元件。核酸水平研究和电镜观察也证实该重组质粒能够在LMH细胞中利用DHBV固有的增强子和启动子进 行有效复制、转录及表达，由此也证明所构建的重组体可以用于体内基因免疫，为其后建立鸭体内实验感染标准化模型提供实验依据。另外，我们进一步用本实验室构建的APOBEC3G真核表达质粒和PCR2?1-DHBV1?5重组质粒共同转染LMH细胞系进行抑制实验以证实该DHBV体外实验模型的初步应用。APOBEC3G是一种天然免疫分子，具有抗病毒感染的效应〔6,7〕。实验结果显示，APOBEC3G能明显降低DHBV核衣壳相关DNA的水平，并且显示出剂量依赖性，表明APOBEC3G也可能非特异性地抑制DHBV复制，但其作用机制尚待进一步研究。

【】
  　　〔1〕 胡权,雷延昌,张振华,等? 湖北麻鸭乙型肝炎病毒全基因组的克隆和序列分析［J］.病毒学,2006,21(2):163-168.

　　〔2〕 Tang H,McLachlan A.Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(4): 1841-1846.

　　〔3〕 Zhang Z,Torii N,Hu Z,et al.X-deficient wood chuck hepatitis virus mutants behave like attenuated viruses and induce protective immunity in vivo［J］.J Clin Invest,2001,108(10):1523-1531.

　　〔4〕 Condreay LD,Aldrich CE,Coates L,et al.Efficient duck hepatitis B virus production by an avian liver tumor cell line［J］.J Virol,1990,64:3249-32585.

　　〔5〕 Gong SS,Jensen AD,Rogler CE.Loss and acquisition of duck hepatitis B virus integrations in lineages of LMH-D2 chicken hepatoma cells［J］.J Virol,1996,70:2000-2007.

　　〔6〕 Chang SF,Netter HJ,Hildt E,et al.Duck hepatitis B virus expresses a regulatory HBx-like protein from a hidden open reading frame［J］.J Virol,2001,75:161-1707.

　　〔7〕 Lenhoff RJ,Luscombe CA,Summers J.Competition in vivo between a cytopathic variant and a wild-type duck hepatitis B virus［J］.Virology,1998,251:85-958.

　　〔8〕 Lenhoff RJ,Luscombe CA,Summers J.Acute liver injury following infection with a cytopathic strain of duck hepatitis B virus［J］.Hepatology,1999,29:563-571.

　　〔9〕 Meier P,Scougall CA,Burrell CJ,et al.A duck hepatitis B virus strain with a knockout mutation in the putative X ORF shows similar infectivity and in vivo growth characteristics to wild-type virus［J］.Virology,2003,20:291-298.

　　〔11〕 Turelli P,Mangeat B,Jost S,et al.Inhibition of hepatitis B virus replication by APOBEC3G［J］.Science,2004 ,303(5665):1829.

　　〔12〕 Navarro F,Bollman B,Chen H,et al.Complementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G［J］.Virology,2005,333(2):374-386.