邻苯二甲酸二丁酯雄性生殖毒性分子作用机制

                 作者：敖红，林玲，阚海东，陈秉衡，张蕴晖

【摘要】  目的 研究邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸毒性作用的分子机制。方法 运用RT-PCR方法观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对大鼠子代不同发育阶段睾丸的苗勒氏管抑制物质(MIS)、雄激素结合蛋白(ABP)和抑制素(inhibin)表达水平的影响，并采用ELISA法检测DBP染毒后大鼠睾酮水平的变化情况。结果 与对照组比较，各DBP染毒组大鼠睾丸中MIS表达差异无统计学意义，血清总睾酮水平差异无统计学意义，但高剂量DBP(1000mg/kg)组睾丸支持细胞中ABP和抑制素(inhibin)的mRNA表达量显著减少，且与睾丸损害呈时间-效应关系。结论 环境内分泌干扰物DBP可干扰大鼠发育过程中睾丸支持细胞ABP和inhibin的表达，其对性腺发育的影响可能是DBP雄性生殖毒性的主要作用机制之一。

【关键词】  邻苯二甲酸酯类

　　近年来，塑料增塑剂邻苯二甲酸二丁酯(DBP)被认为是一种环境内分泌干扰物，主要表现为雄性生殖发育毒性(染毒大鼠睾丸萎缩、附睾发育不良、尿道下裂等)〔1，2〕。本研究以DBP为邻苯二甲酸酯类(phthalates)的代表物，观察DBP对发育过程中F1代幼鼠睾酮(T)水平和雄激素结合蛋白(Androgen-binding protein,ABP)、抑制素(inhibin)、苗勒氏管抑制物质(MIS)基因表达影响，从调控雄性生殖系统的下丘脑-垂体-性腺轴角度探讨其生殖发育毒性的作用机制。

　　1   材料与方法

　　1?1   试剂   DBP(分析纯，纯度≥99?5%，上海溶剂厂)；吐温-80(化学纯，符合Q/CYDZ-162-97，医药集团上海化学试剂公司)；市售精制大豆油；大鼠睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)；单克隆兔抗带状闭合蛋白?1(zona cocludens?1)，ZO?1)抗体(美国Zymed Laboratories公司)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC?山羊抗兔IgG)(北京中山生物医学有限公司)。

　　1?2   剂量设置及试剂配制   共设3个染毒组，DBP染毒剂量依次为50，200，1000mg/kg。另设1个溶剂对照组(0mg/kg)。准确称取100g DBP置入干净的烧杯中，按1∶2比例加入吐温?80和精制植物油，定容至500ml，为高剂量组；依次配制中剂量和低剂量组，溶剂对照组用1∶2的吐温?80和植物油加蒸馏水配制而成，其中吐温?80和植物油的用量同高剂量组。

　　1?3   动物来源及染毒方法

　　1?3?1   实验动物   SPF级Sprague-Dawley大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，沪动合格证字152号，NO.02-4-20，雌性100只，体重(200±20)g，雄性50只，体重(300±30)g。

　　1?3?2   饲养条件   清洁级动物房，温度为(22±3)℃，相对湿度为50%～60%，人工照明，12h光照，12h黑暗。动物食用标准颗粒饲料，自由饮水。

　　1?3?3   染毒方式   孕鼠灌胃染毒，自妊娠第1d(gestation day 1,GD1)至哺乳期结束〔出生后21d(postnatal day 21,PND21)〕，每天1次，灌胃容积为0?5ml/(100g·bw)。停止染毒后，F1代雄鼠饲养至性成熟期PND70d。

　　1?3?4   实验设计   清洁级SD成年大鼠，适应性饲养1周后，按1∶2比例将雄、雌性大鼠合笼，合笼后每天清晨固定时间做阴道涂片，显微镜下查涂片上有无精子以确定是否受孕。查到精子后，将受孕大鼠取出，按体重随机分配至4个实验组，查到精子的当天确定为妊娠第0d(GD0)。2周交配试验结束后，弃去雄鼠和未怀孕的雌性大鼠，每个实验组由20只怀孕母鼠组成，自受孕第2d(GD1)开始，灌胃染毒至哺乳期结束(PND21)；每天称重一次，并根据体重调节染毒容积；出生后4d(PND4)按照欧洲合作与组织(OECD)实验指南(No.414)要求〔3〕，为保持仔鼠营养的均衡性，进行窝标准化操作，即保持每窝8只仔鼠(4只雌鼠，4只雄鼠)，不足8只的窝剔除，这样对照组、低剂量组和中剂量组各有16窝，高剂量组有14窝。F1代雄性仔鼠出生第1，4和21d，每组选取5只动物，无菌环境中，迅速取下睾丸组织，立即置于放在干冰上的无酶离心管中，-70℃保存至RNA抽提。

　　1?4   血清睾酮水平的测定   采用ELISA方法测定PND70d大鼠的血清睾酮水平，睾酮酶联免疫试剂盒(美国Biotech公司)，按试剂盒说明进行操作。

　　1?5   RNA的提取   用TRIzol试剂一步法提取睾丸组织总RNA。
　　
　　1?6   RT?PCR引物   根据Genebank中SD大鼠的RNA序列，用Primer?5引物设计软件自行设计ABP、Inhibin?α和MIS的引物序列。β?actin(470bp):Sequence 5′?CGGATGTCCACGTCA CACTT?3,anti?sequence 5′?GTTGCTATCCAGGCTGTGCT?3′;ABP(286bp):Sequence 5′?ATCAACTGCTTGGGGTTCAC?3′,anti?sequence 5′?GAGCCTGGTCAGAGGCATAG?3′;Inhibin?α(208bp):Sequence 5′?GCTCTACCAGGGAGCATGAG?3′,anti?sequence 5′?CACCTTCCTCCTAGCTGACG?3′;MIS(307bp):Sequence 5′?AGCAAGGCTTCCCTGACGGT?3′,anti?squence 5′?CAGGGTATA　GCACTAACAGG?3′;GAPDH(153bp):Sequence 5′?GTGCTGAGTATGTCGTGGAG?3′,anti?sequence 5′?TGTCATATTTCTCGTG
GTTC-3′。

　　1?7   RT?PCR程序   向RT?PCR反应液中加入1μl的引物及3μl的模板，混匀后放入PCR仪中反应。PCR扩增条件：50℃逆转录30min；94℃预变性2min；94℃ 30s，55～64℃ 30s［β?actin和ABP的退火温度为56℃，inhibin、MIS和内标磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde?3?Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)的退火温度为58℃］，72℃ 60s,30～35次循环；72℃延伸10min。取5μl水浴产物与1μl加样缓冲液混匀，加至凝胶的加样孔中，电泳。电泳15～30min后在紫外灯下观察结电泳结果，在凝胶成像系统下成像扫描目标DNA片段的灰度，进行半定量分析。

　　1?8   统计方法   采用SPSS11?0软件，进行方差分析。

　　2   结果

　　2?1   PND1d F1代大鼠睾丸MIS表达(图1、表1)   结果可见，片断长度为304bps的性别分化相关基因MIS在对照组和各DBP染毒组大鼠睾丸中表达差异无统计学意义。

　　2?2   PND70d F1代大鼠血清睾酮水平   DBP宫内暴露和哺乳期染毒，F1代仔鼠生长至性成熟期后，取血清测定睾酮含量，以观察DBP对仔鼠睾酮水平的影响。结果表明随着染毒剂量的增大，F1代大鼠血清睾酮水平逐渐降低，但经统计学分析，各组间睾酮水平的差异无统计学意义(P>0?05)。

　　2?3   PND14和PND21d F1代大鼠睾丸ABP和inhibin表达(图2、图3表1)   结果表明，与对照组相比较，高剂量组〔1000mg/(kg·bw)〕PND14和PND21大鼠睾丸ABP和inhibin表达量显著降低，而低剂量组和中剂量组〔50和200mg/(kg·bw)〕比较则差异无统计学意义。ABP在PND21的表达量略高于PND14，而inhibin在PND14表达量高于PND21。

　　表1   DBP染毒幼鼠ABP、inhibin和MIS基因表达结果（略）

　　注：与对照组比较，a P<0?05，b P<0?01

　　C：溶剂对照组；L：50mg/kg DBP染毒组；M：200mg/kg DBP染毒组；H：1000mg/kg DBP染毒组

　　图1   DBP染毒PND1d F1代仔鼠睾丸中MIS表达情况（略）

　　C：溶剂对照组；L：50mg/(kg·bw) DBP染毒组；M：200mg/(kg·bw) DBP染毒组；H：1000mg/(kg·bw) DBP染毒组

　　图2   DBP染毒PND14d仔鼠睾丸中ABP和inhibin表达情况（略）

　　C：溶剂对照组；L：50mg/(kg·bw) DBP染毒组；M：200mg/(kg·bw) DBP染毒组；H：1000mg/(kg·bw) DBP染毒组

　　图3   DBP染毒PND21d仔鼠睾丸中ABP和inhibin表达情况（略）

　　3   讨论

　　目前研究普遍认为，抗雄激素样活性是DBP的雄性生殖发育毒性的毒作用基础〔4-7〕。体外实验研究结果已证实，DBP及其代谢产物单丁基邻苯二甲酸酯(MBP)均不能与雄激素受体(AR)结合，说明其抗雄激素作用不是通过AR进行的。研究发现，DBP染毒可致胎鼠睾丸内睾酮水平下降，而睾酮对于雄性生殖系统的发育和分化具有十分重要的作用(可促进睾丸从腹股沟下降至阴囊和附睾、精囊腺及外生殖器的正常发育等)。因此，DBP染毒大鼠后代出现的附睾发育不良、尿道下裂及隐睾等损害均可能与T下降有关〔8-12〕。本研究发现，随着DBP染毒剂量的增加，血清T水平逐渐下降，但与对照组相比较差异无统计学意义，考虑是由于酶免方法测定的是总T水平，而T需要与支持细胞分泌的ABP结合，才能在曲细精管上皮维持较高浓度及运输至附睾，促进精子生成、成熟及附睾发育成熟，而inhibin也是由支持细胞分泌的糖蛋白，含一个通用的α亚单位和一个性质不同的β亚单位，其作用是通过下丘脑-垂体-性腺轴负反馈调节激素分泌，主要对FSH分泌起抑制作用，也可在曲细精管内减少精原细胞的有丝分裂。结果表明，高剂量〔1000mg(kg·bw)〕的DBP能够减少睾丸支持细胞中雄激素结合蛋白和inhibin的mRNA表达量，说明DBP可以通过损伤睾丸支持细胞，使其分泌的蛋白ABP和inhibin明显减少；另一方面，ABP的生物学功能是与睾酮结合，发挥睾酮的生物学作用，其表达减少导致能发挥有效生物学作用的睾酮水平下降，这可能是DBP致附睾发育不全等雄激素依赖的生殖系统损害的一个可能的作用机制。另外，DBP的生殖发育毒性还可能与胚胎性别分化过程中的MIS密切相关〔2〕。因此，本研究用RT-PCR方法观察DBP对MIS表达的影响，结果表明，DBP宫内暴露和哺乳期染毒的F1代雄性仔鼠睾丸内MIS表达无明显改变，说明DBP对MIS明显影响，DBP的生殖发育毒性作用并不是通过该途径。本研究结果表明，DBP宫内暴露和哺乳期染毒的F1代雄性仔鼠睾丸内MIS表达无明显改变，大鼠血清中总睾酮水平也没有明显改变，但高剂量〔1000mg(kg·bw)〕的DBP能够显著抑制大鼠睾丸支持细胞ABP和inhibin的表达，ABP表达量降低导致有生物学功效的睾酮水平下降，因此，DBP的雄性生殖发育毒性可能并不是通过MIS抑制胚胎分化过程，而主要是改变了与睾酮结合的相关蛋白表达和干扰下丘脑-垂体-性腺轴的负反馈过程，从而引起附睾等雄性生殖器官发育障碍。

【】
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