农药咪鲜安雌激素样作用机制体外研究
【关键词】 咪鲜安；雌激素样作用；MCF-7细胞；雌激素受体
摘要： 目的 用体外试验检测农药咪鲜安的雌激素样作用，并对其可能的作用机制进行探讨。方法 将人乳腺癌细胞株（MCF-7）细胞在含10%小牛血清的RPM11640培养基中进行半开放式贴壁培养，加受试物前2周，改在含10%去激素小牛血清的无酚红RPMI 1640培养基中培养。设溶剂对照组、阳性对照组及5个不同浓度的咪鲜安样品组，采用MCF-7细胞增殖试验、四甲基偶氮噻唑蓝（MTT）试验和生长曲线观察咪鲜安对MCF-7细胞增殖的影响，并通过雌激素受体（ER）结合试验分析咪鲜安与ER的结合情况，探讨可能的作用机制。结果 咪鲜安在10-7～10-5mol/L剂量范围内可诱导MCF-7细胞增殖，差异有统计学意义（P<005或P<001），且存在剂量-效应关系；咪鲜安能竞争性地与ER结合，从而抑制125I-E2与ER结合。结论 咪鲜安具有雌激素样作用，其作用机制在于其竞争性地与ER的结合。
关键词：咪鲜安；雌激素样作用；MCF-7细胞；雌激素受体
Study on estrogenic activity and mechanism of prochloraz in vitro
Abstrat:Objective To examine the estrogenic-like activity of the pesticide prochloraz by tests in vitro and study the possible mechanism.Methods MCF-7 cells were maintained in RPMI1640 medium containing 10% bovine serum.Two weeks before the addition of the test compound the cells were transformed into phenol red-free RPMI1640 medium containing 10% charcoal/dextran treated bovine serum.There are seven cell groups deal with different treatments:a vehicle control group,a positive group and five proliferation test,MTT test and growth curve were used to assess the effect on the proliferation of MCF-7 cells by prochloraz,and estrogen receptor(ER)binding test was used to analyze the binding ability of prochloraz with ER. Results Prochloraz can induce the proliferation of MCF-7 cells at 10-7～10-5mol/L with dose-effect relationship,and this effect is significantly different from vehicle control(P<0.05 or P<0.01).Our study also show that prochloraz can bind with ER and inhibit the bind of125I-E2 with ER.Conclusions Prochloraz has estrogenic activity which caused by its bind with ER.
Key words: prochloraz;estrogenic activity;MCF-7 cell;estrogen receptor
农药咪鲜安(prochloraz)，系咪唑类广谱杀菌剂，Vinggaard等曾报道过咪鲜安的抗雄激素活性〔1〕。本研究曾通过体内试验证明咪鲜安具有雌激素样作用〔2〕。本文在体外实验条件下观察咪鲜安对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖的影响及其与雌激素受体(ER)竞争性结合的能力，对其雌激素作用进行探讨，并研究其可能的作用机制。
1 材料与方法
11 细胞培养 人乳腺癌MCF-7细胞在本实验室常规传代培养。
12 受试物与试剂 咪鲜安原药(纯度98%，浙江绍兴东湖生化有限公司)；17-β-雌二醇(E2)(美国Sigma公司)；125I-E2及分离试剂(北京北方生物制品研究所)；MTT(上海华舜生物工程有限公司)；二甲基亚矾(DMSO，天津市化学试剂一厂)；RPMI1640培养基、无酚红RPMI1640培养基产品(美国Hyclone公司)；高融合型细胞培养用小牛血清、去激素小牛血清(上海纬群生物工程有限公司)。
13 试验方法
131 细胞培养与观察 MCF-7细胞培养在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃恒温、5％CO2、100％湿度下培养。用含025％胰酶、002％乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液消化传代。正式试验开始前2周〔3〕，将MCF-7细胞转入上激素培养基(含10％上激素小牛血清的无酚红RPMI1640培养基)中培养。
132 咪鲜安对MCF-7细胞增殖的影响(1)MCF-7细胞增增殖试验：将在去激素培养基中培养的MCF-7细胞消化接种于24孔细胞培养板，浓度为5×103个细胞／ml，每孔加1ml去激素培养基，预培养24h后，弃去旧培养基，每孔加2ml含各剂量受试物的上激素培养基。以无水乙醇(1％)为溶剂对照，以E 2(10-9mol／L)为阳性对照，咪鲜安设10-8，10-7，10-6，10-5，10-4mol／L等5个剂量组。各组设3个以上平行样。在37℃恒温、5％CO2、100％湿度下培养5d后，用含025％胰酶、002％EDTA的消化液消化，用吸管吹打均匀，用血球计数板计数。以增殖效应(proliferative effect,PE)、相对增殖效应(relative proliferative effect,RPE)作为评价指标，公式为：PE=试验组细胞数／溶剂对照组细胞数；RPE=(试验组PE-1)／(阳性对照组PE-1)×100％。(2)MTT试验：参照〔4〕方法进行。
133 咪鲜安对MCF-7细胞生长曲线的影响 细胞培养同MCF-7细胞培养增殖试验，咪鲜安剂量为10-5mol／L，以无水乙醇(1％)为溶剂对照，以E2(10-9mol／L)为阳性对照。细胞培养至1、3、5、7d后，消化，用红细胞计数板计数，并绘制各组MCF-7细胞生长曲线。
134 雌激素受体(ER)结合试验 参照文献〔5〕方法进行。阳性对照E 2采用了5个浓度(10×10-10，50×10-10，10×10-9，50×10-10和10×10-8)，同时设溶剂对照(无水乙醇)和阴性对照。
2 结果
21 咪鲜安对MCF-7细胞增殖的影响
211 MCF-7细胞增殖试验(表1) 咪鲜安在10-7～10-5mol/L剂量范围内可诱导MCF-7细胞增殖，与溶剂对照组比较差异有统计学意义(P<005，P<001)，且存在剂量-效应关系，在10-5mol/L可诱导MCF-7细胞最大增殖，其RPE为12584％。
表1 咪鲜安MCF-7细胞增殖的影响（略）
注：与溶剂对照组比较，*P<005，**P<001
212 MTT试验(表2) 与溶剂对照组比较，10-5mol／L咪鲜安作用24h可促进MCF-7细胞增殖(P<005)，随着作用时间延长至96h，10-7～10-5mol／L咪鲜安均能促进MCF-7细胞增殖(P<005，P<001)，且咪鲜安对MCF-7细胞的增殖作用存在剂量-效应关系和时间-效应关系。
22 咪鲜安对MCF-7细胞生长曲线的影响(图1) 咪鲜安(浓度为10-8mol／L)刺激MCF-7细胞增殖的生长曲线与E 2(浓度为10-9mol／L)相似，从作用第3d开始，与溶剂对照组比较，咪鲜安、E2生长曲线明显上移，且在培养3～7d细胞处于对数生长期。
23 雌激素受体（ER）结合试验
231 咪鲜安与ER特异性结合（表3） 随着受试物浓度的不断提高，咪鲜安、E2竞争性抑制125I-E2与ER结合的能力亦增加，125I-E2与ER的特异结合率随之下降，存在剂量-反应关系。
表2 咪鲜安对MCF-7细胞增殖的影响（略）
注：与溶剂对照组比较，* P<005，**P<001
图1 咪鲜安对MCF-7细胞生长曲线的影响（略）
表3 咪鲜安雌激素受体结合试验结果（略）
注：与溶剂对照组比较，* P<001
232 抑制曲线（图2） 以受试物的对数浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制竞争性抑制曲线。咪鲜安与E2作用相似，随着浓度的不断增高，其竞争性抑制125I-E2与ER结合的能力也逐渐增强。
图2 咪鲜安的ER竞争性抑制曲线（略）
3 讨论
本试验所用的MCF-7细胞来源于人乳腺癌细胞，其雌激素受体表达阳性，具有雌激素依赖性，广泛应用于环境雌激素活性的评价。咪鲜安对MCF-7细胞增殖的结果显示，咪鲜安与E2作用相似，其细胞增殖观察终点的PE、RPE和PR等评价指标均高于溶剂对照组，差异有统计学意义（P<005,P<001），表明咪鲜安能够促进MCF-7细胞增殖；生长曲线分析显示，咪鲜安、E2生长曲线明显上移，培养3～7d，细胞处于对数生长期，也表明咪鲜安能够刺激MCF-7细胞增殖；MTT试验结果还表明，咪鲜安对MCF-7细胞的促增殖作用存在剂量-效应关系和时间-效应关系，表明咪鲜安具有环境雌激素活性。大多数环境雌激素发挥雌激素效应的前提是竞争性地与ER结合，而且受体亲和力与雌激素活性之间存在明显相关性，因此，可根据外源化学物与ER的特异性结合来评价其环境雌激素活性。本文显示，咪鲜安能竞争性地与ER结合，从而抑制125I-E2与ER的特异性结合，且随着剂量的增加，其竞争性结合ER的能力增强，导致125I-E2与ER的特异结合率下降，即呈现出剂量-反应关系。表明咪鲜安的雌激素活性由ER介导，咪鲜安通过使已经与ER结合的雌激素游离下来或抢先占据ER结合位点而产生环境雌激素效应。
〔1〕 Vinggaard AM,Nellemann C,Dalgaard M,et al.Antiandrogenic effects in vitro and in vivo of the fungicide prochloraz［J］.Toxicol Sci,2002,69(2):393-406.
〔2〕 单晓英，李百祥.农药咪鲜安环境雌激素活性的研究［J］.公共卫生，2005，21（5）：596-597.
〔3〕 朱毅，舒为群，田怀军.影响MCF-7细胞增殖试验相关因素的初步研究［J］.第三军医大学学报，2003，25（11）：977-979.
〔4〕 余增丽，张立实，徐培渝，等.三种增塑剂对乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响［J］.中华预防医学杂志，2003，37（3）：150-153.
〔5〕 王心如.毒实验方法与技术［M］.北京：人民卫生出版社，2003：113-115.
