甲醛诱导MRC-5细胞适应性反应蛋白质研究

            作者：李习艺，庄志雄，刘建军，杨晓华，卫秦芝，黄海燕

【关键词】  甲醛；适应性反应；蛋白质组

　　摘要： 目的   研究甲醛诱导真核细胞适应性反应及其可能的机制。方法   建立甲醛刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应模型；采用AlamarBlue还原率检测细胞增殖。双向凝胶电泳分离细胞总蛋白，图像分析后选取差异蛋白点进行质谱鉴定。结果   AlamarBlue检测结果表明，低剂量甲醛预刺激可诱导细胞适应性反应。双向凝胶电泳结果显示，甲醛刺激后19个蛋白斑点发生变化，肽指纹图谱及肽序列标签鉴定了其中13个蛋白斑点，已鉴定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延长因子1-γ，磷酸丙糖异构酶、60S酸性核糖体蛋白P0、75kDa热休克蛋白、70kD热休克蛋白样结合蛋白、钙依赖磷脂结合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌动蛋白交叉连接因子1、核纤层蛋白B2、ATP合成酶α链、蛋白酶体α亚基6，这些蛋白功能涉及转录调节、蛋白折叠、信号传导、能量代谢、细胞骨架等各个方面。结论   低剂量甲醛可诱导MRC-5细胞适应性反应，多种蛋白参与细胞的适应性反应调控。

　　关键词： 甲醛；适应性反应；蛋白质组

　　Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human embryonic fibroblasts cells  
　　Abstract： Objective   To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its possible mechanism.Methods   After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-treated MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in gel then identified by tandem mass spectrum.Results   The results of AlamarBlue reducing rate showed that low concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，triosephosphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa,similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-actin crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.These identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing,protein folding，redox regulation,cell structure and cell signaling.Conclusion   Adaptive response can be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involving in a modulation of diverse cellular functions.

　　Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics
     
　　适应性反应（adaptive response）是机体受到低剂量环境因子预刺激后对后续高剂量的刺激产生耐受的现象。研究表明〔1〕，许多环境刺激因子低剂量接触可诱导适应性反应。但适应性反应是否为界普遍存在的现象，适应性反应的机制还未阐明。甲醛(FA)是常见的环境化学污染物，早期研究发现，机体接触低剂量甲醛可能诱导产生某种耐受与适应现象，但尚未对其机制进行探讨〔2，3〕。本实验利用建立的甲醛适应性反应细胞模型，采用蛋白质组学技术研究了甲醛刺激后人胚肺成纤维细胞蛋白质表达差异，并用串联质谱鉴定差异蛋白，为了解甲醛诱导细胞适应性反应的分子机制提供依据。

　　1   材料与方法

　　11   材料   甲醛(上海标准试剂）、硫脲(美国Sigma公司)；等电聚焦胶条(13cm pH4～7)、尿素、二巯基苏糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸盐、碘乙酰氨(美国USP公司)；胰蛋白酶(测序级)、丙烯酰胺(美国Promega公司)；AlamarBlue染料(美国Biosource公司)；其余试剂采用国产分析纯。

　　12   方法

　　121   细胞培养   MRC-5细胞来源于成都肿瘤研究所，培养于改良的伊格培养基(DMEM)，含10％胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素。FA临用前用无血清DMEM配制。

　　122   AlamarBlue检测细胞增殖   将细胞接种于96孔板，至对数生长期，按实验方案分别加入适应性反应剂量(10μmol/L)及攻击剂量(500μmol/L)的甲醛，对照组分别加入相同体积的无血清DMEM培养基，培养结束前4h每孔加入10μl染料，继续培养4h用酶标仪测吸光度值AlamarBlue还原率。

　　123   双向凝胶电泳   参照Amersham公司技术手册及本实验室改进的技术方法〔4〕，上样量90μg，上样体积250μl，等电聚焦42000～48000vhs，聚焦时间19～21h。样品收集方案：FA染毒低剂量组为10μmol/L刺激12h，高剂量组为500μmol/L FA刺激5h，适应组为10μmol/L FA预刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，空白对照组加入相应体积无血清DMEM，收集不同批次的细胞重复至少3次。

　　124   图像采集和分析   染色后的双向电泳凝胶用的图像扫描仪扫描(瑞典Amersham公司)后采用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行图像分析。分析过程包括蛋白质斑点检测及编辑、背景扣除、以全体点之和作归一化处理后进行斑点匹配。分析3次独立实验所得二维电泳胶，结果以占总蛋白点灰度值的百分比表示。最大比值(Max ratio)为各组数值间最大值与最小值的比，如各组间有为0的数据，Max ratio计为100000。

　　125   质谱检测及数据库搜索   切取在不同批次胶上重复性较好的差异表达的蛋白点，胶内酶解后用质谱分析(ABI4700,美国ABI公司)检测，激光强度355nm, 200Hz,选定5个最强峰做串联质谱，所得肽谱用搜索引擎(MASCOT)对人类蛋白组数据库(IPI HUMAN)搜索。

　　13   统计分析   采用SPSS110软件进行单因素方差分析；二维电泳图像分析采用ImageMaster 2D Platinum5.0软件分析。

　　2   结果

　　21   低剂量FA预刺激对MRC-5细胞增殖的影响   MRC-5细胞分别给予500μmol/L FA刺激5h，及10μmol/L FA预刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，检测AlamarBlue还原率。结果显示，空白对照组AlamarBlue还原率为(0.5771±0.0238)，高剂量组下降至(0.4922±0.019)，适应组细胞为(0.56911±0.03383)，差异有统计学意义。

　　22   低剂量FA预刺激后MRC-5细胞双向电泳图谱差异   经图像分析发现，对照组MRC-5细胞检测到(834±74)个蛋白点，低剂量组为(917±118)个，高剂量组为(820±116)个，适应组为(874±107)个，凝胶匹配后发现，19个蛋白点表达发生改变，变化量达2倍以上，见表1。表1   FA刺激后二维电泳差异表达的蛋白点（略）

　　23   低剂量FA预刺激后MRC-5细胞差异蛋白质谱分析及数据库搜索   选择19个差异表达 的蛋白点进行鉴定，经肽指纹图谱(PMF)及肽序列标签(MS／MS)鉴定了其中13个蛋白点，其余因无法得到好的肽指纹图谱或搜索数据库时无法得到可信度较高的结果而未能鉴定。已鉴定的蛋白结果见表2。

　　3   讨论

　　本研究结果显示，低剂量FA预刺激后细胞可耐受更大剂量FA的攻击，提示FA可诱导细胞产生适应性反应。磷酸丙糖异构酶参与多种能量代谢途径；二磷酸核苷酸激酶与三磷酸核苷合成有关，是癌基因c-Mye的激活因子；蛋白酶体参与泛素依赖的蛋白降解；60S酸性核糖体蛋白PO与E.Coli蛋白L10功能相似；75kDa热休克蛋白及70kDa热休克蛋白样结合蛋白作为分子伴侣或分子伴侣结合蛋白发挥其生物学效应；微管-肌动蛋白交叉连接因子1、核纤层蛋白B2与细胞骨架相关；钙依赖磷脂结合蛋白I(ANX I)为钙依赖的磷脂结合家族成员，具有多种生物学功能；延长因子1在蛋白翻译过程中起重要作用：ATP合成酶α链与ATP合成有关，提示甲醛诱导的细胞适应性反应是一个复杂的过程，需要多种蛋白共同参与。本研究所鉴定的甲醛适应性反应相关蛋白中，热休克蛋白和ANX I的诱导表达与氢醌诱导的适应性反应蛋白质组学研究结果有共同之处〔4〕。提示这2种蛋白可能在化学物诱导的适应性反应的共同机制中具有重要作用。已有研究表明，在应激条件下热休克蛋白的表达对细胞具有保护作用〔5〕。ANX I也可被热应激、过氧化氢、亚砷酸盐等多种因素诱导，提示ANX I也可能是一种热休克蛋白(HSPs)〔6〕。HSPs在化学物诱导的适应性反应中所起的作用是特异性的抑制或非特异性，其表达是适应性反应产生的因或果，以及HSPs与其他适应性反应相关蛋白之间的关系都有待进一步研究。

　　表2   FA调节蛋白Mascot数据库搜索结果（略）

　　注：a PMF鉴定结果；b MS/MS鉴定结果

　　〔1〕   刘树铮.低水平环境因子与适应性反应［J］.中华放射医学与防护杂志，1998，18(5)：310-315.

　　〔2〕   Zwart A，Woutersen RA，Wilmer JW,et al.Cytotoxic and adaptive effects in rat nasal epithelium after 3-day and 13-week exposure to low concentrations of formaldehyde vapour［J］.Toxicology，1988，51(1)：87-99.

　　〔3〕   Nunoshiba T，Hashimoto M，Nishioka H.Cross-adaptive response in Escherichiacoli caused by pretreatment with H2O2 against formaldehyde and other aldehyde compounds［J］.Murat Res，1991，255(3)：265-271.

　　〔4〕   李习艺，庄志雄，刘建军，等.低剂量氢醌诱导人胚肺成纤维细胞适应性反应的研究［J］.卫生研究，2005，34(3)：277-280.

　　〔5〕   Basha M，Lee GJ，Breci LA，et al.The identity of proteins associated with a small heat shock protein during heat stress in vivo indicates that these chaperones protect a wide range of cellular functions［J］.J Biol Chem，2004，279(9)：7566-7575.

　　〔6〕   Rhee HJ，Kim GY，Huh JW,et al.Annexin I is a stress protein induced by heat,oxidative stress and a sulfhydryl reactive agent［J］.Eur J Biochem，2000，267(11)：3220-3225.