大蒜素对大鼠肝损伤细胞因子保护作用

【摘要】  目的 研究大蒜素对高脂饮食致大鼠慢性肝损伤的保护作用及内毒素(Lps)刺激引起肝脏枯否细胞(KCs)分泌细胞因子的变化。方法 Wistar大鼠随机分为3组，10周后腹主动脉采血测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白细胞介素(IL)?6、IL?(10)、肿瘤坏死因子(TNF)?α水平，取肝组织用于组织病理切片的制备。分离培养KCs，检测在Lps刺激下KCs上清液中IL?6、IL?10、TNF?α的水平。结果 大鼠发生慢性肝损伤时，血清ALT及IL?6、TNF?α水平明显升高(P<0?05)，IL?10水平显著下降(P<0?01)，大蒜素可减轻慢性肝损伤，降低血清IL?6水平(P<0?05)。各组大鼠分离培养KCs在加入Lps刺激后，上清液中IL?6、TNF?α水平变化与以上结果十分相似，药物组L?10水平显著升高(P<0?05)。结论 大蒜素对肝脏的保护作用，可能通过调节KCs对细胞因子的分泌来实现。

【关键词】  大蒜素

　大蒜素作为一种来源广泛的含硫化合物，其对四氯化碳、酒精等引起的肝损伤有明显保护作用。研究发现，大蒜素对高脂饮食引起的慢性肝损伤有明显的保护作用，但机制尚未阐明。为此，我们通过复制大鼠慢性肝损伤模型，观察大蒜素对肝脏枯否细胞(KCs) 分泌调节的影响。

　　1  材料与方法

　　1?1  材料

　　1?1?1  实验动物  Wistar 雌性大鼠，体重150～170g(山西医科大学动物中心)。

　　1?1?2  主要试剂及药物  胆固醇(北京化学试公司)；大蒜素胶囊(湖北金龙药业公司)；IV型胶原酶、胎牛血清培养液(DMEM)、Percoll液、内毒素(Lipopolysaccharide,Lps from Escherichia coli 0111:B4)(美国Sigma公司)；白细胞介素(IL)?6、IL?10、肿瘤坏死因子(TNF)?α(解放军总科技开发中心放射免疫所)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)。

　　1?2  方法

　　1?2?1  动物模型的建立  选用雌性Wistar大鼠36只，正常喂养1周后随机分为3组，对照组正常饮食饲养；模型组给予高脂饮食(普通饲料+5%的胆固醇+15%的玉米油)；药物组高脂饮食同时隔日大蒜素(0?5%，10ml/kg)灌胃。10周后各组取实验动物8只，1%戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉采血处死动物，取肝左叶置于10%中性福尔马林固定备做病理切片。

　　1?2?2  血清指标的检测  采集的血液经肝素抗凝后，3 000r/min离心15 min，分离血浆，用于丙氨酸氨基转移酶(ALT)、IL?6、IL?10、TNF?α水平的检测，按试剂盒说明书进行操作。

　　1?2?3  枯否细胞的分离、培养及鉴定  采用改进Seglen胶原酶两步灌流和Percoll密度梯度离心法分离得到各组大鼠肝脏细胞，经5%CO2、37℃恒温培养箱孵育4h,洗去未贴壁细胞。经台盼蓝非特导性酯酶染色，活性和纯度分别达到95%时，调细胞数为5×106，接种于48孔培养板中，每组8孔。

　　1?2?4  培养上清液细胞因子的检测  于培养液中加入100mg/ml Lps2滴，4h后收集培养上清，用于IL?8、TNF?α、IL?10的测定。

　　1?3  统计分析  计量资料用±s表示，采用SPSS 12?0软件进行方差分析(SNK法)。

　　2  结果

　　2?1  慢性肝损伤结果

　　2?1?1  肝组织病变化  肝组织病理学显示，模型组与药物组大鼠体肝组织均出现不同程度的弥漫性改变，肝内可见到大量的脂肪空泡(肝小叶内含脂滴细胞/总细胞数>1/3)及肝细胞气球样变、小叶内和汇管区有大量的以单核细胞、淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，但未见明显肝纤维化，表明慢性损伤大鼠发生脂肪肝炎；与模型组相比，药物组大鼠肝组织炎性细胞浸润明显减轻。

　　2?1?2  血清ALT的变化  对照组为(61?5±12?6)u/L，而模型组与药物组ALT水平明显升高，分别为(210?3±105?4)，(144?1±72?9)u/L，与对照组比较，P<0?05。药物组与模型组比较，ALT水平显著下降，差异有统计学意义，P<0?05。

　　2?1?3  血清IL?6、IL?10、TNF?α的变化(表1)  随着动物发生慢性肝损伤，模型组与药物组IL?6、TNF?α水平明显升高 ，IL?10则明显下降；药物组IL?6水平明显低于模型组，而TNF?α降低及IL?10升高，差异无统计学意义。

　　表1  大蒜素对血浆胞因子的影响（略）

　　注：与对照组比较,a P<0?01；b P<0?05；与模型组比较,c P<0?05

　　2?2  枯否细胞的分离、培养结果

　　2?2?1  KCs形态的改变与对照比较  分离KCs结果表明，对照组KCs体积较小，形态相对规整，胞浆突起纤细，胞浆内仅有少量空泡。而模型组KCs体积明显增大，核浆比例增大，胞浆突起明显增多、变粗、胞浆高度空泡化，吴典型的活化状态。

　　2?2?2  KCs分泌细胞因子的变化(表2)  加入Lps后，模型组与药物组培养上清液中IL?6、TNF?α水平明显高于对照组，IL?10、水平发生明显下降。药物组与高脂组比较IL?6、TNF?α水平显降低，而IL?10水平显著升高。

　　表2  大蒜素对大鼠KCs培养上清液细胞因子的影响（略）

　　注：与对照组比较，a P<0?01，b P<0?05；与模型组比较，c P<0?01，d P<0?05

　　3  讨论

　　近年来，非酒精性脂肪肝炎发病率明显增高，尽管该病的发生机制尚未完全阐明，但对先天肥胖性ob/ob小鼠和fa/fa大鼠研究表明，KCs分泌功能紊乱参与了疾病的发生。其成为脂肪肝，特征有胰岛素抵抗、肥胖、脂质代谢紊乱，与人类的非酒精性脂肪肝炎直接相关〔１〕。Yang等〔２〕提出肥胖个体枯否细胞功能紊乱可以增加肝细胞对内毒素的敏感性，从而加速脂肪肝炎的形成。对肥胖、瘦素受体功能紊乱的大鼠、小鼠枯否细胞体外培养发现，枯否细胞表型异常，在给予内毒素刺激后与对照比较，促炎因子IL?6、TNF?α表达增加，而抑炎因子IL?10表达抑制〔３〕。尽管肝脏各种细胞均可产生TNF?α，但普遍认为内毒素活化枯否细胞是TNF?α产生的主要来源。研究表明，TNF?α在脂肪肝炎的发生、发展中起了重要作用，其不仅可通过活化受体，产生各种适应性蛋白、促进肝细胞的抗凋亡〔４〕，也可引发肝细胞线粒体释放出活性氧引起肝细胞死亡、凋亡和肝脏的炎病浸润。IL?6是肝脏KCs产生的另一种重要促炎因子，可与TNF?α在协同促进肝内炎症的产生。相反IL?10可通过抑制各种促炎因子的生成，从而减少肝内中性粒细胞的浸润。大蒜素是从大蒜中提取出的一种有效成分，其作用十分广泛。有报道其对CCl4及乙醇所致的急、慢性肝损伤有明显的保护作用〔5，6〕。在我们以往的研究中也发现，其对高脂饮食所致肝脏慢性损伤也有较好的保护作用。为进一步证实大蒜素是否可能通过调节KCs分泌功能来改善肝组织慢性损伤，实验中以高脂饮食复制慢性肝损伤模型。检测结果表明，模型组大鼠发生脂肪肝炎时，血浆促炎因子IL?6、TNF?α明显升高而抑炎因子IL?10显著降低，大蒜素可抑制IL?6水平的升高。体外实验进一步证实，大蒜素可降低KCs对IL?6、TNF?α的表达，在提高IL?10的表达方面作用十分显著。说明大蒜素可通过调节KCs的分泌，改善肝脏内促炎因子与抑炎因子的失衡，参与对肝脏慢性损伤的保护作用。

【文献】
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