广东地区人禽流感H5N1血凝素基因特征与进化

        作者：黄平，柯昌文，邹丽容，李晖，陈秋霞

【关键词】  人禽流感；H5N1；毒株；血凝素(HA)基因；进化

　　摘要： 目的   通过对广东地区人禽流感H5N1毒株(HA)基因序列的变异分析，揭示毒株HA基因变异与进化。方法   对广东地区人禽流感H5N1毒株(A/GD/01/06)HA基因测序，同时检索全球各地人禽流感H5N1毒株HA基因，采用SPSS110和DNAStar50软件对检索的人禽流感H5N1毒株HA基因核苷酸序列进行聚类、比对和分析；并结合临床资料对变异毒株进行进化速度分析。结果   1997～2006年，42毒株HA基因序列聚类分成3类；HA基因89氨基酸位点置换，占157％(89／568)；2003～2006年H5N1,毒株通过氨基酸第170～172位(NST／S)位点的置换，增加一个糖基化位点。同义变异中，HA基因Ks为199×10-5～2.58×10-5，生物进化线性回归方程为Y=48×10-9X+1.048×10-5；同时各毒株Ks均大于Ka，进化检验Ks／Ka值显示HA基因进化压力主要来自变异。42株H5N1毒株可以分3条进化途径，1997～1998年毒株为1条，2003～2005年东南亚毒株为第2条途径，2005～2006年毒株为第3条途径。毒株HK-213-03氨基酸变异显示其变异的进化过度性，而2004年毒株TL-L2004-04氨基酸位点变异值得注意。结论   2003～2006年人禽流感H5N1毒株HA基因抗原性与1997年毒株有较大不同，人禽流感H5N1,毒株增加一个糖蛋白位点可能改变毒株致病性；少数毒株氨基酸位点变异较大，值得关注。人禽流感H5N1毒株在自然界变异频繁，但受到鸟禽和人体的免疫压力较小；但随着H5N1,毒株自然进化，H5N1,毒株具有人-人传播能力的概率较大。建议在研制人禽流感H5N1毒株疫苗时，要充分考虑不同毒株HA基因抗原性。

　　关键词： 人禽流感；H5N1；毒株；血凝素(HA)基因；进化

　　Characteristic and evolution on HA gene of human H5N1 avian influenza  

　　Abstract： Objective   To reveal characteristic and evolution on HA geoe of human H5N1 avian influenza by analyzing variation of the nucleotide sequence of HA gene of human H5Nl avian influenza.Methods   HA gene of Guangdong strain was sequenced and others global HA nucleotide sequences of human H5Nl avian influenza from Internet and their variation were clustered and compared and analyzed with SPSS11.0 and DNA Star5.0.Results   Forty-two HA genes of human H5N1 avian influenza in 1997～2006 were clustered into three groups.Eighty～nine amino acids of HA gene were substituted and accounted for 15.7％(89／568).HA gene increased one glycoprotein domain in 170～172 sites(NST／S) in 2003～2006.In the synonymous varimion，Ks in HA gene was between 1.99×10-5～2.58×10-5 and the evolutionary linear regression equation was Y=4.84×10-9X+1.048×10-5.Meantime，Ks was more than Ka in same strain and Ks／Ka value showed that there was not selective pressure in HA gene evolution.H5N1 strain evolution was divided into three clusters，one for strains in 1997～1998，another for strains in 2003～2005 except for strains from China，third for strain from China in 2005～2006.The variation of strain HK-213-03 showed their transitions between 1997 and 2004,and the variations of the amino acids on HA in TL-L2004-04 was remarkable.Conclusion   There was the differences between HA of strains in 2003～2006 and strains in 1997 and one more glycoprofein domain might increase the viral pathogenicity；it was worth noticing variations of the amino acids on HA in TL-L2004-04.Human H5N1 strains evolve frequently in the natural environment,but were not subject to avian or human immunological pressure.However，the probabilities were great that H5N1 strains possess of human-to human transmittion as the natural evolution.The antigenicity of HA gene was needed to consider in vaccine of different human H5N1 strains.

　　Key words： human H5N1 avian influenza;H5N1 strain;HA gene;evolution
     
　　人禽流感是由甲型禽流感病毒(Avian Iufluena Vrus，AIV)的毒株感染人引起的急性呼吸道传染病，目前常见的亚型有H5N1、H7N7和H9N2，其中以H5N1毒性最强〔1，2〕。人禽流感H5Nl毒株属于高致病性禽流感病毒(HPAIV)，毒性主要与基因组节段4编码的血凝素(Hemagglutinin，HA)有关。一般认为，目前人禽流感病原体直接来源于禽鸟流感毒株；但人禽流感病原体基因也许存在自身分子特点。为了解人禽流感HA基因的特征，我们对广东地区首例人禽流感H5N1毒株的HA基因进行序列分析，并与目前世界各地人禽流感H5N1毒株的HA基因序列的变异、抗原性、进化进行比较，以期对人禽流感控制和预防提供理论依据。

　　1   材料与方法

　　11   材料   广东地区首例人禽流感毒株A／GD／1／2006(H5N1)(简为GD-01-06)HA基因序列经测序获得：其他人禽流感毒株序列从基因库(GenBank)检索获得〔3〕,共41株；其中1997年毒株15株，1998年毒株1株，2003年毒株1株，2004年毒株17株，2005年毒株7株。此外广东地区2006年毒株1株。

　　12   方法   根据2004～2005年东南亚地区人禽流感毒株HA基因序列设计并合成引物，HAF：5′AGCAAAAGCAGGG　GTCTAATCTG3′。HAR：5′AGTCCAGACATCTAGGAAYCC3′；对广东地区人禽流感毒株GD106 QIAamp Viral RNA mini Kit(德国QIAGEN公司)提取RNA，进行RTPCR扩增；试剂分别采用QIAGEN Sensiscript Reverse Transcriptase和TaKaRa PyroBest Tag。PCR产物纯化采用QIAGEN Gel Extraction Kit，测序用ABI PRISM BigDye Terminator V30 Ready Reaction Cycle Sequence Kit，在ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer上测序。同时，用不同引物扩增同一基因片断，以检验测序序列的正确性。

　　13   分析〔4-6〕   对检测和检索的HA基因核苷酸序列采用DNAstar50软件进行逐一比对，并确定编码氨基酸序列。然后采用SPSS110软件进行聚类分析，并用DNAstar50软件进行氨基酸变异和进化分析。根据HA基因Ka和Ks值，进化速度；同时根据生物统计学检验公式Z=(Ka-Ks)/［vKa～Ks］1/2，判断是否存在选择作用。将来自1997年香港人禽流感H5N1毒株HK48297毒株为比对基准。核苷酸中腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，简称为a、g、c、t；20种氨基酸也用各自缩写表示。

　　2   结果

　　21   一般情况   毒株GD-01-06(H5N1)的HA基因核苷酸为1704个，核苷酸A、G、T、C分别为597，385，404，318个。HA基因编码567个氨基酸，构成氨基酸数量比例依次为天冬酰胺(简称为N)>丝氨酸(S)>异亮氨酸(I)>谷氨酸(E)>甘氨酸(G)、赖氨酸(K)>颉氨酸(V)>丙氨酸(A)>苏氨酸(T)>天冬氨酸(D)>酪氨酸(Y)>精氨酸(R)>脯氨酸(P)>苯丙氨酸(F)>半胱氨酸(C)>蛋氨酸(M)>色氨酸(w)>亮氨酸(L)，氨基酸序列见图1。       
　　图1   GD-01-06(H5N1)的HA基因氨基酸序列（略）     

　　将HA基因核苷酸资料进行聚类分析，聚类结果分成3类：1997～1998年香港毒株HA基因成为第1类；2003～2005年东南亚毒株HA基因成为第2类；2005～2006年大陆毒株成为第3类。

　　22   同义变异   共有162个核苷酸位点发生同义突变，突变率为943％(161／1707)。设定1997年人禽流感H5Nl毒株HK～482～97为基准，其分离日期为1997年12月；毒株HK21303采样于2003年2月(1888d)，则Ks为19×10-5核苷酸／d；毒株TL1604采样于2004年2月(2253d)，Ks为21×10-5核苷酸／D；毒株VNJP1405采样于2005年1月(2588d)，则Ks为258×10-5核苷酸／D；毒株GD106采样于2006年3月1日(2998d)，则Ks为223×10-5核苷酸／d。得到同义变异Ks线性回归方程：Y=484×10-9X+1048×10-5。

　　23   错义变异   共有91个核苷酸位点发生错义突变，突变率为533%(91/1707)；导致89个氨基酸位点发生变异(另2个核苷酸位点突变导致同一氨基酸位点变异)，157(89/568)氨基酸位点置换。568个氨基酸中，有糖蛋白位点7个，分别位于第27～29位(NST)、第39～41位(NVT)、第181～183位(NNT)、第209～211位(NPT)、第302～304位(NSS)、第499～501位(NGT)、第559～561位(NVT)；另外，1997年毒株HK48397、HK49197、HK50397、HK51497和2004～2006年所有毒株增加第170～172位(NST/S)糖蛋白位点。糖蛋白位点的增加将改变HA基因的抗原性。此外，HA基因的13个半胱氨酸均未发生改变(图1和图2)。可以发现，2003～2006年毒株(包括中国毒株)与1997～1998年毒株氨基酸位点完全不同位点包括R051K、N061D、S100N、N140S、D142E、L154Q、E228R/K、P233S、T336S、N515K、M527I，共11个氨基酸位点；2005～2006年中国毒株GD0106、Anhui105、Anhui205、Guangxi105氨基酸位点变异，在V190R、R199S、E243D、T279A、L285V、M298I、R326K、Q338L位点与1997～2005年其他毒株氨基酸位点不一致。此外，2003年毒株HK21303在A102、A172、T529位点与1997～1998年毒株氨基酸位点一致；毒株TLL200404除L8与1997～1998年毒株氨基酸位点一致，在H195Q、L225S、W246R、R342K、G358A、R506S、R516E、E517R、E518K、S553F位点发生改变 ，不同于1997～2006年其他人禽流感毒株氨基酸序列。图2   42株人禽流感H5N1毒株HA基因核苷酸进化树      毒株HK21303、TL1604、VNJP1405、GD106的Ka值分别为111×10-5、123×10-5、129×10-5、170×10-5核苷酸/日。由于同毒株Ka值均小于Ks值，提示H5N1毒株的负选择作用的存在。根据生物检验公式Z=(Ka-Ks)/［V｜Ka-Ks｜］1/2，V为方差，则4株的Z值分别是：-0729，-0716，-0760，-0605；显示毒株HA基因受到的感染宿主选择性作用不明显〔6〕。

　　24   基因进化   对42株毒株进行同源性比较，发现毒株分成3个系列：1997～1998年香港人禽流感毒株为一个系列，2003～20058年东南亚人禽流感毒株中，核苷酸同源性在954%～100%之间，其中HK48297与HK48697核苷酸序列完全一致；2003～2005年毒株(除外中国毒株)中，核苷酸同源性在929%～996%之间；在所有42株毒株中，核苷酸同源性在901%～100%，核苷酸同源性最小的是HK48197与VN321204毒株。1998年以后，人禽流感经过4年寂静期；2003年出现的人禽流感毒株与1997年毒株存在较大的差异，HA基因抗原决定簇位点发生变异；而在中国内地出现的人禽流感毒株与其他地区的毒株也存一定差异。毒株变异主要表现在2方面，其一是许多氨基酸位点置换导致抗原性改变，其二是第170～172位均增加一个糖蛋白位点。

　　3   讨论

　　截至2006年9月底的248例人禽流感病例中，部分病例分离到毒株；公开的网站收集到符合条件的41株毒株HA基因序列；另有部分毒株由于核苷酸序列太短未选用。此前已有学者采用聚类分析方法应用于甲1型流感基因变异研究〔7〕。自1997年5月香港出现第1例人感染禽流感H5N1毒株病例以后，当年12月再出现17例散发病例；经过4年多寂静期以后，2003年2月人禽流感感染再次出现于香港，此时正值香港SARS流行早期，但侥幸未出现更多病例；2004年1月以后，亚洲地区不断出现人禽流感病例。与1997年毒株基因比较，2003～2006年毒株HA基因核苷酸序列、氨基酸序列、抗原决定簇位点、糖蛋白位点均发生变异。2003～2006年毒株变异最显著特点表现在2方面：（1）许多氨基酸位点置换导致抗原性改变；（2）多数毒株均增加一个糖蛋白位点。2003年毒株HK-213-03是静息4年后再次出现的人禽流感毒株，其11个氨基酸已与2004年以后的毒株一致，但仍有3个氨基酸与1997年毒株一致，显示其变异的过渡性。值得注意的是，毒株TL-L2004-04有10个氨基酸位点与1997～2006年其他毒株均不同，无疑会导致其抗原性和毒性不同。根据世界卫生组织全球流感监测研究协作组报告，2004～2005年毒株分为3个进化枝，每枝间氨基酸序列和血凝抑制抗体(HI)滴度均有差异〔8〕。H5N1毒株血凝素蛋白是由3条糖蛋白肽链分子以非共价结合的三聚体，每一单体由一条重链(HA1)和一条轻链(HA2)经二硫键连接而成。在我们分析的毒株中，没有发现二硫键有改变。糖蛋白位点增加可能对该毒株毒性有加强作用，在积累更多病例后可以进行致病性研究。由于H5N1毒株HA基因存在多条进化途径，建议在研制人禽流感疫苗时要充分考虑不同的抗原性；同时还要充分考虑毒株TL-L2004-04氨基酸位点变异对抗原性的影响。

　　〔1〕   黄平.广东地区流感流行、爆发和分子变异研究［J］.疾病控制杂志，2004，8(2)：144-147.

　　〔2〕   黄平,邓峰.流感〔M〕.广州：广东科技出版社，2004：20-62.

　　〔3〕   http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi〔EB〕.

　　〔4〕   黄平，宋怀东，邹丽容，等.2004年SARS-CoV毒株s基因分子进化特征［J］.中国人兽共患病杂志，2006，22(10):957-960.

　　〔5〕   Zhou Q, Wang W.Detectingnatural selection at the DNA leval［J］.Zoological Research,2004，25(1)：73-80.

　　〔6〕   Song HD,Tucc,ZhaXY.Cross-host evolution of severe acute respiratory syndome coronavirus in palm civet and human［J］，Proc Natl Acad Sci,2005，102(7):2430-2435.

　　〔7〕   张文彤，姜庆五.全球历年人甲型流感病毒H3A1抗原的分子进化研究［J］.中华流行病学杂志，2005，26(11)：843-847.

　　〔8〕   The WHO global influneza program surveillance network.evolution of H5N1 avian influenza viruses in Asian［J］.Emerg Infect Dis,2005,11(10)：1515-1521.