天麻素对染铅大鼠脑细胞凋亡影响

【关键词】  天麻素；铅；凋亡；学习记忆

　　摘要： 目的  探讨天麻素对染铅大鼠脑细胞凋亡及学习记忆功能的影响。方法  选择健康雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组，分别为实验1，2，3，4组和对照组。除对照组外，各组大鼠均给予02%醋酸铅水溶液自由饮用，实验2，3，4组给予天麻素溶液灌胃，浓度分别为100，200，400ng/kg。用Y型迷宫测试学习记忆，用流式细胞仪测定脑细胞凋亡率。结果  （1）在Y型迷宫试验中，实验1组大鼠受电击次数显著高于实验2，3，4组和对照组（P<0.01);大鼠学习受电击次数与天麻剂量呈明显负相关。(2)实验1组脑细胞(包括海马、小脑和大脑皮层)凋亡率显著高于实验2，3，4组和对照组（P<001）；大鼠脑细胞凋亡率与天麻素剂量呈明显负相关。结论  天麻素对染铅大鼠脑细胞凋亡和学习记忆功能损害具有改善作用。

　　关键词： 天麻素；铅；凋亡；学习记忆

　　Effect of gastrodin on apoptosis of brain cells of rats induced by lead 

　　Abstract： Objective  To explore the effect of gastrodin on the apoptosis of brain  cells and the impairment of learning and memory induced by lead in rats.Methods  50 male Wistar rats were chosen and random divided into 5 groups,respectively;1,2,3,4and control,10 rats in every group.Except for control all rats were given solution of 0.2%lead acetate,and at the same time group 2,3 and 4 were give gastrodin at the dosage of 100,200 and 400mg/kg respecitively.The ability of learining and memory of each group was measured by Y-maze test,The apoptosis of brain cells was determinged by flow cytometry(FCM).Results  (1)The number of electric shocks of group1 was significantly increased compared with 2,3,4and control in Y-maze test (P<0.01);and there was a significant dose-response relationship between electric shocks and gastrodin.(2)the apoptosis of brain cells(P<0.01);and a signficant dose-response relationship between apoptosis and gastrodin was found.Conclusion  Gastrodin may improve the apoptosis of brain cells and the impairment of learning and memory induced by lead.

　　Key words： gastrodin;lead apoptosis;learning and memory
   
　　铅是界广泛存在的一种古老的重金属毒物。1991年美国疾病预防控制中心(CDC)规定儿童血铅上限值为048μmol/L。天麻(Rhizoma Gastrodiae,RG)有多种药理作用,如镇静催眠、抗惊厥、保护神经纤维、增强机体抗缺血缺氧及抗氧化能力等作用〔1〕。为了解天麻素对铅所致脑细胞凋亡的影响,本文通过Y型迷宫试验,脑细胞凋亡,研究天麻素对铅所致脑及学习记忆功能损害的改善作用。

　　1  材料与方法

　　11  材料 

　　111  试验动物  初成年雄性Wistar大鼠(1505±694)g(山东大学实验动物中心)。

　　112  试验药品  醋酸铅(天津市大茂化学试剂厂);天麻素(Gastrodin)(昆明制药股份有限公司)；碘化丙啶(PI)(美国Sigma分司)。

　　113  试验仪器  (1)Y型迷宫每大小为15cm×15cm×30cm,底部间隔05cm铺直径2mm的铜栅;任选一臂为安全区,在其上方安装指示灯;另两臂轮流做起步区,通以60V直流电。(2)FACASGalibur型流式细胞仪(flow cytometry,FCM)(美国Bicton-DiGkingson公司)。(3)GFA-4B型石墨炉(日本岛津公司)。

　　12  方法 

　　121  动物分组与处理  选健康大鼠50只,随机分为5组,每组10只分别为:实验1,2,3,4和对照组。除对照组外,其他各组大鼠均给予02%醋酸铅水溶液自由饮用。实验2，3，4组再给予天麻素溶液灌胃,浓度分别为100,200,400mg/kg;实验1组则给予蒸馏水灌胃。每2周测试学习记忆1次。15个月后处死大鼠,测定血铅、脑铅及脑细胞凋亡率。

　　122  测试学习记忆  在晚上安静环境中测定,大鼠由起步区直接逃至安全区为正确,其余均为错误反应。记录学习连续达9/10正确前所受电击次数(即错误次数),以此作为各组大鼠的学习记忆能力。

　　123  血铅、脑铅测定  用石墨炉原子吸收光谱法测定,样品处理方法参照《职业中毒检验》〔12〕。

　　124  细胞凋亡率测定  动物断头处死,取全脑在冰盘上迅速剥离脑组织,剔除软脑膜和血管,分离大脑皮层,海马和小脑,经磷酸盐缓冲液(PBS内含100mg/LRNaseA)洗涤后用虹膜剪剪碎，制成1×106/ml单细胞悬液。将等体积的单细胞悬液与PI染液混合,4℃避光染色20～80min。使用Cellpuest软件获取20000个细胞,用Medfit LT软件分析细胞周期和凋亡率。

　　13  统计分析  采用SPSS100软件进行统计分析。

　　2  结果

　　21  大鼠体重增长情况  随染毒时间的延长,各组大鼠体重均有明显增加,增长速度由快到慢依次为对照组，实验4,3,2,1组,试验结束时,实验1组大鼠体重显著低于实验2,3,4组和对照组(P<005或P<001)。

　　22  血铅、脑铅测定（表1）  实验1，2，3，4组血铅、脑铅浓度显著高于对照组(P<001)，实验1组大鼠血铅、脑铅浓度高于实验3,4组(P<001)。

　　23  测试学习记忆(表2)  随着染毒时间的延长,除对照组外，各组大鼠学习错误次数均明显增加,以实验1组最为显著,其余依次为实验2,3,4组和对照组。试验结束时,实验1组大鼠学习错误次数显著高于实验2,3,4组和对照组(P<001)。大鼠学习错误次数与天麻素剂量呈明显负相关。

　　表1  大鼠血铅、脑铅测定结果（略）

　　注：与对照组比较,a P<001；n=10

　　表2  天麻素对染铅大鼠学习记忆的影响（略）

　　注：与实验1组比较，a P<001；与对照组比较，b P<001；n=10

　　24  脑细胞凋亡率测定  各组大鼠脑细胞凋亡率(包括海马、小脑和大脑皮层)由高至低依次为实验1,2,3,4组和对照组。实验1组脑细胞凋亡率显著高于实验2,3,4组和对照组(P<001)。大鼠脑细胞凋亡率与天麻素剂量呈明显负相关。

　　表3  天麻素对染铅大鼠细胞凋亡率的影响（略）

　　注：与实验1组比较，a P<001;与对照组比较,b P<001;n=10

　　3  讨论

　　天麻可通过抗脂质过氧化作用促进学习记忆、延缓衰老。天麻醇提取物能明显改善小鼠学习记忆能力〔3〕,给小鼠口服天麻煎剂,其血中超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增高〔4〕。D-半乳糖衰老小鼠模型口服天麻4或8g/kg,其血中SOD和皮肤中羟脯氨酸含量显著提高,心肌中脂褐质显著降低〔5〕。脑缺血再灌注损伤可引起海马神经元bcl-2表达减少和bax表达增加,抗呆I号(由天麻素等中药提取物组成)可上调神经元bcl-2的表达和下调bax的表达,表明抗呆I号能抑制缺血再灌注损伤神经细胞凋亡,对神经细胞具有保护作用〔6〕。用大鼠皮层细胞培养8d后置于模拟缺血状态下,5h后神经细胞发生肿胀,膜流动性下降、脂质过氧化物(LPO)含量增加;经过天麻素孵育后LPO含量明显降低,膜流动性增高〔7〕。天麻素还可抵抗谷氨酸氧自由基诱导的PC12细胞损伤〔8〕,天麻提取物能明显抑制邻苯三酚自氧化体系中O-2的产生及H2O2诱发的膜脂质过氧化物化丙二醛的生成〔9〕。说明天麻能清除自由基,保护组织细胞免受损伤;同时还可通过影响凋亡基因bcl-2和bax的表达,而抑制细胞凋亡。本试验发现，天麻素对染铅大鼠脑细胞凋亡具明显的抵抗作用,这可能是其改善染铅大鼠脑细胞功能、提高学习记忆功能的机制之一。

　　〔1〕  高南南,于澍仁,徐锦堂.天麻对老龄大鼠学习记忆改善作用［J］.中药杂志,1995,20(9):562-563.

　　〔2〕  周恒铎.职业中毒检验［M］.北京：人民卫生出版社,1976:116-131.

　　〔3〕  周本宏,张洪,罗顺德，等.天麻提取物对小鼠学习记忆能力的影响［J］.中药药理与临床,1996,12(3):32-33.

　　〔4〕  肖光,王晨光.黄芪、天麻，首乌对小白鼠血SOD活力的影响［J］.锦州医学院学报,1992,13(4):15-16.

　　〔5〕  高南南,于澍仁,刘睿红，等.天麻对D-半乳糖所致衰老小鼠的改善作用［J］.中草药,1994,25(10):521-523.

　　〔6〕  黄建梅,唐一鹏,洪庆涛.抗呆I号对体外模拟脑缺血现灌注损伤海马神经元凋亡调控基因表达的影响［J］.北京中医药大学学报,2002,25(1):38-42.

　　〔7〕  薛柳华,唐一鹏,孙承琳,等.天麻素对缺血再灌注神经细胞膜的保护作用［J］.北京中医药大学学报,1998，21(3):18-21.

　　〔8〕  李运曼,陈芳萍,刘国卿.天麻素抗谷氨酸和氧自由基诱导的PC12细胞损伤的研究［J］.中国药科大学学报,2003,34(5):456-460.

　　〔9〕  周本宏,李荣凌,张春香,等.天麻对红细胞膜过氧化损伤的保护作用［J］.中国药学杂志,2003,23(11):655-657.