砷暴露小鼠肝组织核酸损伤免疫组织化学观察
作者：李秋娟，杨光，叶建新，孙鲜策，陈敏，刘晓芳，朴丰源
【关键词】 砷；肝；8
摘要：目的 为进一步研究砷对肝脏的毒性作用机制提供实验依据。方法 昆明种小鼠40只，随机分为4组：1,2,4mg/L三氧化二砷染毒组和生理盐水组，连续染毒60d，取小鼠肝组织固定，用免疫组化方法观察肝脏组织细胞的8Nitroguanine表达。结果 染砷组小鼠肝细胞出现抗8Nitroguanine免疫染色阳性反应，并随着砷暴露剂量的增加 而呈现明显的剂量-反应关系。结论 慢性低剂量砷暴露可诱发小鼠肝细胞8Nitroguanine的高表达，提示8硝基鸟嘌呤核苷(8Nitroguanine)可以作为砷对肝细胞毒性作用的早期敏感生物标志物。
关键词：砷；肝；8Nitroguanine；免疫组化；核酸损伤
Observation on nucleic acid damage of liver in mice exposed to arsenic in low dose by immunohistochemistry
Department of Hygiene,Dalian Medical University(Dalian 116027,China)Abstract： Objective To provide evidence for exploring the mechanism of arsenicinduced hepatoxicity.Methods Forty mice were diveded into 4 groups, e.g.,one controls and 3 experimental groups(1 mg/L As2O3,2 mg/L As2O3 and 4 mg/L AS2O3).As2O3 was administered for 60 days.Immunohistochemistry method was used to investigate 8Nitroguanine expression in liver tissue of mice.Results Expression of 8Nitroguanine was observed in the liver tissue of mice exposed to arsenic and there was relationship of doseresponse in expression of 8Nitroguanine with the increase arsenic dose.Conclusion Arsenic induced high expression of 8Nitroguanine in liver tissue of mice.8Nitroguanine might be an earlier sensitive bio-marker for arsenic toxicity to liver.
Key words：arsenic；liver；8Nitroguanine；immunohistochemistry；nucleic acid
近年来，动物实验和人群流行病学调查均表明，砷可引起不同程度的肝损伤、肝纤维化、肝硬化及肝癌〔1-3〕。研究表明，砷可影响体内氧化还原平衡，增高肝细胞脂质过氧化水平，降低谷胱甘肽(GSH)浓度和抗氧化酶活性，使肝组织受到自由基损害〔4，5〕。但是，其机制目前尚不十分清楚。本研究以小鼠为研究对象，以8Nitroguanine作为生物标志物，通过免疫组化方法，观察砷对肝组织细胞核酸的损伤作用，为探讨砷的肝脏组织毒性作用机制提供依据。
1 材料与方法
11 材料 抗8-硝基鸟嘌呤单克隆抗体(日本岛津公司)；UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司）；其他试剂均为分析纯。
12 方法
121 动物处理 成熟健康昆明种小鼠40只，雌雄各半(大连医科大学实验动物中心)。按体重随机分为4组：1,2,4mg/L的三氧化二砷(As2O3)染毒组和生理盐水对照组。小鼠通过饮用含As2O3自来水方式染毒，每天测定水消耗量。连续染毒60d后，断头处死并立即取肝组织固定。
122 肝组织形态学观察(图1) 肝组织经福尔马林固定后，常规石蜡包埋，5μm连续切片，在65℃温箱中烤片60min；苏木素伊红(HE)染色，光镜下进行组织形态学观察。
123 肝组织免疫组织化学观察 按照免疫组化染色法(SP)〔5〕，在肝组织切片上滴1∶300稀释的鼠抗人8Nitroguanine单克隆抗体，在4℃条件下孵育过夜，然后按UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒的步骤进行，经二氨基联苯胺(DAB)显色，HE复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明，中性树胶封片。阅片时，先观察整张切片，再随机选择不同区域的5个高倍视野，显微镜下拍照，并应用图象分析软件对8Nitroguanine表达的平均吸光度进行定量的分析(Imagepro plus 45)。
13 统计分析 应用SPSS 115软件进行统计分析。用Scheff's test方法进行组间均数比较，以P<005表示差异有统计学意义。
2 结果
21 肝组织病观察(图1) 肝组织形态学观察结果，对照组肝细胞核膜完整，核仁清晰，胞浆正常(图1A)。而染砷组肝脏细胞肿胀，胞浆出现空泡状改变，细胞核固缩、碎裂或溶解，肝组织有明显的病理改变(图1B)。
图1 小鼠肝组织SP观察结果(HE，×200)（略）
22 肝组织细胞核酸损伤的免疫组织化学观察(图2) 小鼠肝组织抗8Nitroguanine的免疫组化结果显示，染砷组小鼠肝组织细胞中靠近细胞膜的胞浆被染成棕褐色(图2B,C,D)，呈现明显的抗8Nitroguanine阳性反应，而对照组小鼠肝组织细胞中几乎无8Nitroguanine的表达(图2A)。各组小鼠肝细胞的抗8Nitroguanine免疫染色用平均吸光度值表示，低、中、高3个实验组的平均吸光度值分别为(0029±0014)，(0042±0016)和(0257±0155)，明显大于对照组(0003±0002)，差异有统计学意义(P<005或P<001)，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量反应关系。
图2 小鼠肝组织抗8Nitroguanine组织化学染色结果(HE，×200)（略）
3 讨论
以往的动物实验表明，砷可在大鼠肝组织中蓄积，慢性砷暴露大鼠肝组织的砷含量与暴露浓度呈正相关〔6〕。肝脏是砷在体内代谢的主要场所，在砷的甲基化代谢过程中产生多种具有强氧化性产物对肝细胞有毒性作用〔7〕。研究表明，活性氮族(reactivenitrogen species，RNS)在砷所致毒性中发挥重要作用。Chattopadhyay报道，人胚和新生大鼠肝细胞染砷后，显微镜观察发现，细胞产生较多的NO和脂质过氧化物，说明砷能诱导NO和ROS过度产生〔8〕。ROS和NO之间涉及许多信号传导通路，它们之间也存在着协同作用。高浓度的NO可以与氧自由基等反应而生成过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-)等RNS〔5〕。ONOO-能转变为反式结构，发挥氧化应激的作用，影响细胞代谢，使DNA/RNA链断裂，启动脂质过氧化，导致组织损伤。 8Nitroguanine是由过氧亚硝酸阴离子或二氧化氮等活性氮族攻击核酸的产物，可进一步导致突变、癌变的发生。Ma等曾报道胃炎病人的胃粘膜上皮中有8Nitroguanine表达，并认为8Nitrogaanine不仅是一个炎症的标志物，还是一种判断是否有癌变倾向的指示物〔9〕。本实验结果显示，慢性砷暴露的小鼠肝组织细胞中有8Nitroguanine的高表达，说明砷暴露可以导致肝的核酸损伤。而且，8Nitroguanine的表达主要集中在靠近细胞膜的胞浆中。由于8Nitroguanine在DNA的结构中进行迅速的脱嘌呤反应，它在RNA中要比在DNA更为稳定〔10〕。本实验结果提示，砷暴露小鼠肝组织8Nitroguanine的高表达可能主要与砷致肝脏细胞RNA损伤有关。关于砷的肝脏毒性作用分子机制，还有待于进一步研究。综上所述，在慢性较低剂量的砷暴露小鼠肝脏细胞中出现8Nitroguanine的高表达和病理改变，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量反应关系，说明8Nitroguanine的高表达与砷的肝细胞毒性作用有关。同时也提示，8Nitroguanine可作为检测砷的肝细胞毒性作用的早期敏感生物标志物。
〔1〕 Santra A,Maiti A,Das S,et al.Hepatic damage caused by chronic arsenic toxicity in experimental animals［J］.J Toxicol Clin Toxicol,2000,38:395-405.
〔2〕 Liu J,Liu YP,Goyer RA,et al.Metallothionein-I/II null mice are more sensitive than wild-type mice to the hepatoxic nephrotoxic effects of chronic oral or injected inorganic arsenicals［J］.Toxicol Sci,2000,55:460-467.
〔3〕 黎平，刘铭，李达圣，等.燃煤污染型砷中毒临床症状体征分析［J］.地方病学杂志，2000，19：139-141.
〔4〕 李昕，皮静波，孙洋，等.长期染砷致家兔肝脏蛋白质巯基水平及巯基代谢相关酶活力下降［J］.中国地方病学杂志，2000，23：10-12.
〔5〕 李友.砷中毒机制研究进展［J］.国外医学卫生学分册，2001，28(5)：261-264.
〔6〕 Xie YX,Trouba KJ,Liu J,et al.Germolec biokinetics and subchronic toxic effects of oral arsenite,arsenate,monomethlyarsonic acid, and dimethylarsinic acid in v-Ha-ras transgenic mice［J］.Environ Health Perspect,2004,112:1255-1263.
〔7〕 安艳.砷甲基化代谢产物的作用机制［J］.职业卫生与病伤，2000,15(3)：176-177.
〔8〕 Chattopadhyay.Arsenic induced changes in growth development and apoptosis in neonatal and adult cells in vivo and tissue culture［J］.Toxicol Lett,2002,128:73-84.
〔9〕 Ning Ma,Yukihiko Adachi,Yusuke Hiraku,et al.Accumulation of 8nitroguanine in human gastric epithelium induced by helicobacter pylori infection［J］.Biochem Biophys Res Commun,2004,319(2):506-510.
〔10〕 Somchai Pinlaor,Puangrat Yongvanit,Yusuke Hiraku,et al.8nitroguanine formation in the liver of hamsters infected with opisthorchis viverrini［J］.Biochem Biophys Res Commun,2003,309(3):567-571.
