氡暴露对大鼠气管-支气管上皮细胞转化影响
1 材料与方法
1?1 实验动物处理 实验用Wistar雄性大鼠，7～8周龄(上海斯莱克实验动物有限责任公司)许可证号：SCXK(沪)2003-0003。采用自制HD-3型多功能移动式氡室，对大鼠动态吸入染毒。按照氡染毒的累计暴露量，分为60，90，120工作月(Working Level Month,WLM)和对照组共4组，每组6只动物。染毒时间每天8h，每周6d，染毒期间动物自由活动饮食。
1?2 选择性培养基制备 选择性F12培养基为Ham’s F12培养基，含有2%胎牛血清，5mg/L胰岛素，0?3μ mol/L氢化可的松。
1?3 气管-支气管上皮细胞的分离和培养 实验组及对照组大鼠气管-支气管上皮细胞的分离和培养采用本实验室建立的消化后刷洗法，见［1］。
1?4 细胞集落形成率 收集大鼠气管-支气管上皮细胞，制成细胞悬液，以1×105个/60mm培养皿接种于无血清完全F12培养基中37℃5%CO2培养箱中培养，7～8d后计数其形成的细胞集落数，并根据接种的细胞量细胞集落形成率(CFE)。一个细胞集落的标准是含有15个细胞以上的细胞团，CFE=细胞集落数/接种的细胞量×100%。
1?5 细胞存活率 根据CFE得出的结果，计算出大鼠气管-支气管上皮细胞存活率。其计算公式为：细胞存活率=氡暴露组细胞集落形成率/对照组细胞集落形成率×100%。
1?6 转化细胞筛选 上述细胞集落计数后，即转入选择性F12培养基对气管-支气管上皮细胞进行筛选。4d换液1次，选择性培养5周，计数转化细胞集落并统计转化率(TF)，TF=转化细胞集落数/进入选择的细胞集落数×100%。
1?7 转化细胞系的建立 大鼠气管-支气管上皮细胞经选择性培养5周后，根据Kitamural［2］报道的形态学标准，细胞小而密集的Ⅲ或Ⅳ型集落是具有转化趋向的集落，倒置显微镜下鉴定后，用消毒棉签除去其他的集落细胞，使每皿只含有一个转化集落，继续培养，对Ⅲ或Ⅳ型集落扩增，然后转移到培养瓶中，进行传代培养。
2 结果
2?1 氡染毒对大鼠气管-支气管上皮细胞转化的影响(表1) 随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的集落形成率相应下降(图1，r=-0?98,P＜0.01)，而转化率则随之增加，呈一定的剂量-反应关系。当暴露量达到90WLM时，无论集落形成率还是转化率，与对照组相比较，差异均有统计学意义，P＜0?01。
表1 氡暴露对大鼠气管-支气管上皮细胞的转化（略）
注：与对照组比较，*P＜0?01
图1 大鼠气管-支气管上皮细胞集落形成率和转化率与氡累积暴露量的关系（略）
2?2 氡染毒对大鼠气管-支气管上皮细胞存活的影响 随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的存活率相应下降，60WLM组为(88?2±10?9)%，90WLM组为(71?5±8?9)%，120WL组为(60?7±11?5)%。
2?3 转化细胞系 从累积暴露量为90WLM组动物得到的1个转化细胞集落连续传代12代，从120WLM组动物得到的1个转化细胞集落连续传代16代后，这2个细胞系均出现明显衰老现象，并生长缓慢，然后终止传代，分别收集细胞，冷冻保存，用于后续相关研究。
3 讨论
本实验结果表明，随着氡暴露累积剂量的增加，大鼠气管-支气管上皮细胞的集落形成率和存活率相应下降，并呈一定的剂量-反应关系。表明氡染毒后大鼠气管-支气管上皮细胞出现明显的细胞毒性。本实验中，对早期转化集落中的Ⅲ或Ⅳ型集落扩增后传代培养，得到2个连续传代的非致瘤细胞系，分别传代12和6代。但这2个细胞系因明显的衰老迹象而终止传代，未能进行软琼脂集落形成和裸鼠成瘤实验。细胞转化是细胞建系过程中重要的一步，是建立永生细胞系的基础，可为研究氡致肺癌提供一个直接的途径。细胞转化是少数细胞异常增殖的结果，而这种异常增殖与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关［3］。α粒子是否通过影响这两类基因而引起细胞转化甚至恶性转化，有待进一步研究。
【】
〔1〕 崔凤梅，苏世标，聂继华，等.大鼠气管-支气管上皮细胞的分离、鉴定和培养［J］.辐射卫生，2005，14(4)：246-247.
〔2〕 Kitamural H,Fitzgerald DJ,Li LA,et al.Morphological characterization of transformed colonies in rat tracheal epithelial cell cultures exposed to carcinogens［J］.Cancer Research,1986,46:4631-4641.
〔3〕 Ross JA,Rosen GD.The molecular biology of lung cancer［J］.Curr Opin Pulm Med，2002,8(4):265-269.
