八氯二丙醚对体外培养CHL细胞DNA合成影响
【摘要】 目的 研究八氯二丙醚对体外培养仓鼠肺细胞(CHL)DNA合成影响。方法 采用DNA荧光定量测定方法,观察不同染毒浓度(0?250，0?187，0?125，0?062，0?046，0?031μg/ml)对CHL细胞DNA合成影响。结果 八氯二丙醚浓度为0?062，0?046μg/ml时DNA合成量与对照组比差异有统计学意义，表现为合成增加(P<0?05)，浓度为0?250，0?187，0?125μg/ml时，则表现为合成抑制(P<0?05)，且呈剂量-反应关系(P<0?05)；0?250μg/ml浓度在脱离染毒后2，4，6，12h内DNA合成量持续下降。结论 在低浓度时(0?062，0?046μg/ml)，八氯二丙醚可引起CHL细胞DNA合成能力增加,而在高浓度时(0?250，0?187，0?125μg/ml)则表现为DNA合成抑制，且这种抑制由DNA损伤引起。
【关键词】 八氯二丙醚
八氯二丙醚(Octachlorodipropyl ether，S2)化学名为2，3，3，3，2，3，3，3－八氯二丙醚。S2作为农药的增效剂，可以明显提高拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类药物的杀虫效果〔1〕。已有研究表明，体外实验中S2为可疑致突变物，并且体外可直接导致小牛胸腺DNA交联率增加〔2-5〕。体内实验表明，S2蚊香烟雾对小鼠肺细胞和睾丸细胞的DNA合成有抑制作用〔6〕。本文采用DNA荧光定量测定方法，观察S2不同染毒浓度对CHL细胞DNA合成影响，以进一步探讨其遗传毒性。
1 材料与方法
1?1 材料
1?1?1 仪器 荧光分光光度计(美国Crary eslipse公司)；低温冷冻离心机(美国Sigma公司)；水浴锅、涡旋器。
1?1?2 试剂 八氯二丙醚(江都恒生化工有限公司),纯度>93%，分子量377?0，比重1?62，杂质含量，H2SO4<0?1%,HCl<0?05%；Hoechst33258荧光染料,小牛胸腺DNA(美国Sigma公司)，其他试剂均为分析纯。
1?1?3 细胞株及培养条件 中国仓鼠肺细胞株(CHL)(江苏省药物检验所)，用含10%新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100U青霉素、谷氨酰胺的RPMI1640培养基(GIBCO),于37℃、5%CO2培养箱中培养、传代,取生长良好的细胞用于实验。
1?2 方法
1?2?1 S2对CHL细胞的半数致死浓度(IC50)实验 在96孔培养板上接种CHL细胞，每孔100μl，接种密度为1×105/孔，培养24h后每孔加入不同浓度的S2溶液，各剂量组终浓度分别为0，1，2，4，8，32，64μg/ml，每个剂量组设定6个平行孔。染毒24h后弃去每孔中的培养液，加入含10%四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)5mg/ml的RPMI1640培养液(不含小牛血清)，继续培养4h后，弃去MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μl后用酶标仪测定各孔在570nm波长处的吸光度(A)值。Bliss法IC50,并测得细胞存活率＞95%的S2浓度。
1?2?2 S2对CHL细胞DNA合成影响的测定 取生长良好的细胞接种于24孔培养板，每孔2ml，接种密度为0?7×106/孔,培养24h后每孔加入不同浓度的S2溶液，溶剂对照组浓度分别为0?031，0?046，0?062，0?187，0?250μg/ml，每个剂量组设定6个平行孔,染毒24h后，参照Domas TR等〔7〕,Brunk CF等〔8〕方法及陆瑛等〔9〕介绍的方法改进,测定每组的DNA含量。其方法为在每一测量样本中加入荧光缓冲剂(No?33258),并在荧光分光光度计下读数。其激发波长为365nm,发射波长为458nm。对照参数为小牛胸腺DNA的标准曲线。
1?3 统计分析 采用SAS 8?01软件进行方差分析及Dunnett't检验。
2 结果
2?1 S2对CHL细胞的IC50测定结果 由于S2难溶于水，为配成准确的浓度系列，我们采用少量的乙醇作为溶剂，为此先对乙醇的毒性进行测定。结果表明，当乙醇浓度≤0?4%时,细胞的生长不随其含量增加而变化,通过对各浓度组之间的A570值进行比较,差异无统计学意义(P>0?05)。当乙醇浓度＞0?4%时,细胞的A570值降低,差异均有统计学意义(P<0?05)，故进行IC50及DNA合成影响的测定时使用的乙醇浓度<0?4%，用Bliss法求得S2的IC50为5?478μg/ml，95%CI=4?277～7?015μg/ml，细胞存活率＞95%的最高S2浓度为0?5μg/ml(表1)。
表1 S2的IC50测定结果（略）
2?2 S2对CHL细胞DNA合成影响的测定
2?2?1 DNA浓度与荧光强度关系的标准曲线(表2) 结果表明，DNA含量在24?24～835?82ng/ml之间时,二者有良好的线性关系。故染毒结束收获细胞进行测定时，各组被测细胞数均取1×106个左右，使其灵敏度能满足本实验的要求。相关系数r=0?990,回归方程为y=0?2127x+2?5602。经检验，r值及回归方程的斜率差异有统计学意义。
表2 DNA浓度与荧光强度的关系（略）
2?2?2 S2对CHL细胞DNA合成影响(表3) 结果显示，S2浓度在0?031～0?046μg/ml时，DNA合成量处于增加趋势，其中0?046，0?062μg/ml浓度组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0?05)，表现为合成增加。浓度在0?250，0?187，0?125μg/ml时则表现为合成抑制(P<0?05)，且呈剂量-反应关系(P<0?05)(图1)。
表3 不同浓度组相对于对照组DNA的增殖率（略）
2?2?3 DNA合成受到抑制后的修复情况 为进一步观察DNA合成受到抑制后的修复情况，选择0?250μg/ml组，在脱离染毒后2，4，6，12h内观察其DNA合成情况，结果表明，脱离染毒后4、6、12h内与0h比较，差异有统计学意义(P<0?05)(图2)。
图1 不同浓度S2染毒24h后，CHL细胞DNA合成情况（略）
图2 0?250μg/ml组脱离染毒后不同时间段DNA合成情况（略）
3 讨论
在增殖性的细胞群体中，程序外DNA合成(UDS)只有半保留DNA合成水平的1%～5%〔10〕。研究发现，当S2的浓度在0?031～0?062μg/ml之间染毒24h时，细胞的DNA合成处于增加趋势，提示细胞DNA合成可能在受到抑制前有一个代偿性升高阶段，其中0?062，0?046μg/ml浓度组已经大大超出了1%～5%水平，由此推测这些浓度组染毒时所产生的DNA合成量增加是UDS增加所造成。提示在这些浓度下，可能已经引起DNA损伤，导致细胞修复DNA的能力增强，随着染毒浓度的加大，造成半保留DNA合成抑制，出现DNA合成大量下降，且0?250μg/ml浓度在脱离接触后的2～12h出现持续下降的趋势，表明虽然已经脱离S2接触，但由于损伤依然存在，DNA合成量仍然持续下降，因此，认为S2所造成的这种抑制是通过DNA损伤引起的，而不是通过代谢阻断途径而呈现出DNA合成抑制作用，这与已对S2引起DNA损伤的研究结果较为一致，即在一定剂量范围内，S2吸入可引起小鼠DNA损伤〔11〕。体外实验也可导致小牛胸腺DNA交联率增加〔12〕，染色体畸变实验为阳性〔13〕。
【】
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