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作者：杨占田，陈静宏，楚雍烈，曹峻岭，王治伦，师钟丽，郭雄
【关键词】 一氧化氮合酶
摘要：目的 探讨T2毒素对软骨细胞合成一氧化氮(NO)的影响。方法 胎儿软骨细胞体外培养，用MTT法检测软骨细胞存活率；用Griess重氮化法测定软骨细胞培养上清液中NO含量；用Western blot检测软骨细胞一氧化氮合酶(iNOS)的表达。结果 T2毒素在质量浓度在1-2000μg/L的范围内，软骨细胞存活率对其呈较典型的浓度依赖关系和时间依赖关系，而且随着作用时间的延长, 浓度依赖关系更为明显； T2毒素刺激软骨细胞分泌NO和表达iNOS蛋白。结论 T2毒素引起的软骨细胞损伤和生长抑制与T2毒素刺激软骨细胞表达iNOS蛋白和分泌NO增多有关。
关键词：T2毒素；软骨细胞；一氧化氮；一氧化氮合酶
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of T2 toxin on nitric oxide (NO) production and nitric oxide synthase (iNOS) expression in chondrocytes. Methods Human chondrocytes cultured in vitro were treated with different concentrations of T2 toxin in different time (1-5 day). Cell viability of the treated cells was measured by MTT assay; The levels of NO in culture media were detected by colorimetric method of Griess assay; iNOS protein was measured by Western blot. Results Dosedependent and time dependent effects of T2 toxin were found on T2 toxin treated chondrocytes within a certain range of concentration (1-2000μg/L) and a periods of time (1-5 day); The levels of NO in T2 toxin treated culture media were higher than that of normal control group; Overexpression of iNOS was detected in T2 toxin treated cells. Conclusion T2 toxin can enhance NO production and upregulate expression of iNOS. NO plays an important role in T2 toxin induced growth inhibitory and toxic effects.
KEY WORDS: T2 toxin; chondrocytes; nitric oxide; nitric oxide synthase
T2毒素的病因学意义是目前大骨节病研究领域的热点。大量研究发现T2毒素可致软骨细胞损伤[1]。本研究采用胎儿软骨细胞体外培养，观察T2毒素对软骨细胞分泌一氧化氮(nitric oxide, NO)及其诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, iNOS)的影响，旨在探讨T2毒素致软骨细胞损伤的分子机理。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 DMEM培养基(GIBCO)、胰蛋白酶、透明质酸酶和II型胶原酶(Sigma)、
iNOS单克隆抗体(博士德生物工程公司)、四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、N1萘乙二胺盐酸盐和磺胺(华美生物工程公司)， T2毒素由军事医学院毒物药物研究所杨进生教授赠送，752型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，EI x800型通用酶标仪(基因公司)。
1.2 软骨细胞培养及分组 中孕引产胎儿的软骨细胞原代培养方法同[2]。第一代软骨细胞培养48h后随机分为对照组、T2毒素处理组，将不同质量浓度T2毒素(1、5、10、20、50、100、1000、2000、4000、8000μg/L)溶于DMEM完全培养基中(含150mL/L FCS，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)。根据T2毒素对软骨细胞的作用，再选择1、10、20μg/L T2毒素处理组作进一步的检测。
1.3 观察指标
1.3.1 MTT法检测细胞存活率 第一代软骨细胞悬液200μL(含5×103的软骨细胞)接种于96孔组织培养板，贴壁生长48h后，加入含不同浓度T2毒素的培养液，每组设6个平行孔，分别培养1-5d，然后加入20μL MTT(5g/L)，继续培养4h后，弃去培养液，加入二甲基亚砜150μL，用力振荡5min使甲月替结晶溶解完全，最后置于酶标仪490nm处测定A值。细胞存活率用下列公式：细胞存活率＝实验组A 对照组A×100%
1.3.2 NO浓度测定 鉴于NO的性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定样品中的亚硝酸盐和硝酸盐可作为衡量NO合成的指标。本实验采用Griess重氮化法。取细胞培养上清0.5mL, 加入0.5mL Griess试剂(10g/L磺胺和1g/L萘乙二胺盐酸盐等量混合)，混匀室温放置10min，于紫外分光光度计540nm处测定A值，以亚硝酸钠为标准，计算NO浓度。
1.3.3 iNOS的检测 采用Western bloting分析。各组T2毒素作用于软骨细胞5d，收集各组软骨细胞，常规提取蛋白质，进行SDSPAGE后，电转移至硝酸纤维(NC)膜上，按文献进行免疫印迹(Western blotting)检测，凝胶成像系统测定积分吸光度值。
1.4 统计分析 结果以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 10.0软件包统计分析，各组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 T2毒素对软骨细胞存活率的影响 随着T2毒素质量浓度的增加，细胞存活率明显下降，细胞生长抑制也越来越明显，呈浓度依赖关系；随着作用时间的延长，T2 毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐加强，呈时间依赖关系。各组T2毒素作用于软骨细胞5d时抑制作用已达到近饱和(图1)。图1 不同浓度T2毒素在不同作用时间对软骨细胞存活率的影响（略）
2.2 T2毒素对软骨细胞NO浓度的影响 不同质量浓度的T2毒素均能明显增加培养上清液中NO的浓度(P<0.05)，并呈浓度依赖关系(表1)。表1 不同质量浓度T2毒素在不同作用时间对软骨细胞合成NO的影响（略）
2.3 T2毒素对软骨细胞表达iNOS蛋白的影响 T2毒素能增强iNOS表达 (P<0.05)，在实验所选范围内，浓度越高，iNOS表达越强，刺激作用越明显(图2和表2)。
图2 T2毒素诱导软骨细胞表达iNOS蛋白的Western blotting 电泳结果（略）
表2 T2毒素诱导软骨细胞表达iNOS蛋白的积分吸光度值（略）
3 讨 论
镰刀菌广泛存在于界中。T2毒素是由镰刀菌产生的单端孢烯族毒素(Ts)中最毒的一种，是食物中常见的污染性霉菌毒素。国内外研究表明，饮食中污染T2毒素可以对机体造成多种病理损害，如血液毒性、免疫毒性以及对软骨的损伤等。本研究用MTT法检测了T2毒素对软骨细胞的损伤和生长抑制作用，发现软骨细胞经不同质量浓度T2毒素作用后，随着T2毒素质量浓度的增加，细胞存活率明显下降，细胞生长抑制越来越明显，呈浓度依赖关系。随着T2毒素与软骨细胞作用时间的延长，T2 毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐加强，呈时间依赖关系。
NO是一种高反应性、细胞毒性的自由基，受许多因子调节,其在许多疾病中对组织造成损伤已得到了证实 。关节软骨细胞和滑膜成纤维细胞是产生NO的潜能细胞。近年研究发现，NO参与软骨破坏的病理过程。在体内，NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化L精氨酸产生。NOS按表达方式分为自发型(包括神经型和内皮型)和诱导型(iNOS)两种。自发型仅产生少量NO，而诱导型在细胞因子如白细胞介素1(IL1)、肿瘤坏死因子(TNF)和细菌脂多糖(LPS)刺激下即可产生大量NO。
本实验结果表明，不同质量浓度的T2毒素均可增强iNOS表达，并引起软骨细胞NO分泌明显增加，呈浓度依赖关系。表明T2毒素引起的损伤与软骨细胞产生NO有关，NO是T2毒素引起的软骨细胞损伤的诱导者之一。
本室已有研究表明，T2毒素能明显提高培养上清液中IL2和TNF的质量浓度(结果另文发表)， 我们由此可以推测，T2毒素引起软骨细胞大量分泌IL2和TNF，二者单独或协同进一步刺激软骨细胞iNOS表达，并分泌大量NO，引起软骨细胞损伤。
NO参与各种疾病的组织损伤, 如抑制细胞增殖、诱导各种细胞凋亡。Lee等研究表明一氧化氮合酶抑制剂N硝基L精氨酸(LNAME)可使外源性NO分泌减少，培养软骨细胞的凋亡程度随之减轻。 Hashimoto等用NO诱导软骨细胞凋亡并分离出凋亡小体。推测NO可能通过两种方式诱导软骨细胞损伤。一是高浓度的NO能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶，从而抑制线粒体呼吸，造成组织细胞损伤；二是NO与超氧化阴离子 (Ｏ-2)反应，生成氧化亚硝基阴离子(ONOO-)，在酸性条件下(如病理条件下) 迅速分解为Ｏ-2和NO-2自由基, 这两种自由基具有很强的细胞毒性，可造成组织细胞损伤。
近来研究发现，大骨节病病区儿童血清NO质量浓度高于非病区儿童，T2毒素作为大骨节病热点可疑病因，它对软骨细胞合成NO究竟产生了何种影响，我们的初步研究结果表明T2毒素可以诱导软骨细胞合成NO增多，T2毒素引起的软骨细胞损伤与软骨细胞合成NO增多有关，二者结果有一定的一致性。当然，由于本实验是体外实验，并不能为大骨节病和骨关节病提供确切病因学证据，只能是发病机理的一个探讨。
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