芪丹通脉片对急性缺血再灌注大鼠心肌信号转导系统PI3K
作者：李军昌，王宗仁，王跃民，王文，王文勇，王长海，姚菊峰
【摘要】 目的 观察中药芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡和细胞信号转导系统中磷脂酰肌醇?3激酶(PI3K)、丝(苏)氨酸激酶(Akt)和细胞外信号调节激酶(Erk1/2)的影响。方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(模型组)和芪丹通脉片预处理组。生理盐水或芪丹通脉片灌胃7d后，大鼠麻醉开胸，结扎冠状动脉前降支40min，再灌注4h。伊文氏兰和TTC染色测定心肌梗死范围，梗死面积(IS)与缺血区面积(AAR)的比值(%, IS/AAR)；TUNEL方法定性和定量检测心肌细胞凋亡指数；Westernblot测定信号蛋白的表达。结果 芪丹通脉片组的心肌梗死范围明显小于模型组[(28.8±8.4)% vs. (49.1±10.3)%，P<0.01]；其心肌细胞凋亡指数亦显著低于模型组[(11.6±2.3)% vs. (20.3±4.5)%，P<0.01]；而其Akt和Erk1/2的磷酸化表达水平增加，与模型组比较分别增加了2.5倍和1.9倍(P<0.01，P<0.05)。结论 芪丹通脉片能够抑制缺血再灌注所致的心肌细胞损伤，并影响生存信号通路PI3K/Akt和Erk1/2的活化水平。
【关键词】 芪丹通脉片；再灌注；心肌；磷脂酰肌醇?3激酶；丝(苏)氨酸激酶；细胞外信号调节激酶
Effect of Qidan Tongmai Tablets on myocardial signal transaction PI3K/Akt and Erk1/2 in rats with acute ischemia reperfusion
ABSTRACT: Objective To investigate the effect of Qidan Tongmai Tablet (QDTMT) on myocardium ischemia reperfusion injury and signal pathway phosphatidylinositol?3 ?kinase (PI3K)/ serine/threonine kinase (Akt) and (the mitogen?activated protein kinase p42/44 extra?cellular signal?regulated kinases (Erk1/2). Methods Male Sprague?Dawley rats were divided into 3 groups randomly: sham, ischemia reperfusion(model) and QDTMT treatment. The animals were anesthetized and open?chest animals were subjected to 40min mycardial ischemia followed by 4h reperfusion after administering saline in sham and model or QDTMT for 7d. The area at risk and infarct size were determined by Evan?s blue and triphenyl tetrazolium chloride methods; cardiac myocyte apoptosis was determined both qualitatively and quantitatively by terminal deoxynucleotidyl transfease?mediated dUTP by nick?end labeling analysis methods. The expression of PI3K signaling cascade and Erk1/2 was determined by Western blotting analysis. Results The IS/AAR and apoptosis index were significantly attenuated respectively in QDTMT?treated animals (28.8±8.4)%,(11.6±2.3)% vs. (49.1±10.3)%, (20.3±4.5)% in models (P<0.01, P<0.01). The expression of p?Akt and p?Erk1/2 was induced 2.5 fold and 1.9 fold higher respectively in QDTMT?treated animals than in models (P<0.01, P<0.05). Conclusion The results suggest that QDTMT may be able to protect the heart against reperfusion?induced injury mediated by the increase of phosphorylating Akt and Erk1/2.
KEY WORDS: Qidan Tongmai tablet; reperfusion injury; myocardium; phosphatidylinositol?3 kinase; serine/threonine kinase; mitogen?activated protein kinase p42/44 extra?cellular signal? regulated kinase
缺血性心脏病本质的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死或凋亡，尽早恢复血液灌流是缺血性心脏病的首要措施。然而，再灌注损伤成为患者从缺血后复流获益的最大障碍。多种预适应方法和后处理能够减轻再灌注损伤,而且这种保护作用与生存信号通路的活化相关[1]。研究表明，芪丹通脉片能够减少急性心肌梗塞面积，促进心脏功能恢复[2]。本研究旨在进一步观察芪丹通脉片在对急性缺血再灌注心肌的保护作用，及其对信号转导系统磷脂酰肌醇?3激酶(phosphatidylinositol?3 kinase, PI3K)、丝(苏)氨酸激酶/(serine/threonine kinase, Akt)和细胞外信号调节激酶(the mitogen?activated protein kinase p42/44 extra?cellular signal?regulated kinase, Erk1/2)活性的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康成年SD雄性大鼠30只，体重250-270g，由第四军医大学动物中心提供。
1.2 药品和主要试剂 芪丹通脉片浸膏干粉(黄芪30g、丹参30g、当归15g、红花30g、桂枝10g、生药2.862g/g干粉，配制成324g/L混悬液，第四军医大学科研药厂提供)；原位细胞凋亡检测试剂盒购自德国Roche公司；PI3K、Akt、p?Akts437、Erk1/2和pErk1/2均购自Cell Signaling公司。
1.3 心肌缺血再灌注模型的制备 按照[3]的方法。雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉。颈部正中切口，分离气管并插入套管，行呼气末正压通气(空气通气量：20mL/kg，频率48-50次/min)。经右颈总动脉插入左心导管以测心功能参数。标准导联II记录心电图(RM6200多导生理记录仪，成都仪器设备厂)。在胸骨左侧约0.5cm处从第3至5肋纵行切口开胸，剪开心包，暴露心脏，以左冠状动脉主干为标志，在左心耳根部下方2mm处用无创小圆针穿过左冠状动脉左前降支根部下方的心肌表层，穿5?0线，将缝合线穿过小硅胶管后备用；待心电图恢复稳定10min后记录正常参数。在硅胶管远端的收紧缝合线至硅胶管形成弓状并固定，以阻断左前降支阻断血流造成缺血，以心电图ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功指标，缺血40min，松解并除去硅胶管和多余缝合线，恢复左冠状动脉前降支实现血再灌注，逐层缝合胸壁,恢复自主呼吸。
1.4 实验方案 将大鼠随机分为3组：假手术组、缺血再灌注组和芪丹通脉片处理组。假手术组，动物开胸，冠脉下穿线但不结扎。模型组和假手术组均给予生理盐水[10mL/(kg·d)]灌胃，芪丹通脉片处理组给予芪丹通脉片浸膏混悬液灌胃[3.24g/(kg·d),10mL/(kg·d)]。第7天，灌胃完成30min后开始造模。
1.5 心肌梗死范围的测定 实验结束时，重新结扎包绕冠状动脉左降支，经颈动脉快速注入 10g/L伊文氏兰染色区分缺血区和非缺血区(显示为兰色),置于-20℃冻存20min后在结扎线以下，以心脏长轴等份4-5份，切片，经10g/LTTC(triphenyl tetrazolium chloride)37℃孵育30min区分坏死区呈不着色，缺血区呈砖红色，数码摄像，通过Optimax图象处理软件进行分析，并计算梗死面积(infarct size, IS)与缺血区面积(area at risk, AAR)的比值(%, IS/AAR)
1.6 TUNNEL法检测心肌细胞凋亡情况 再灌注结束，迅速剪下心脏，置于冰的PBS中洗净残血，分离左心室前壁缺血区，40g/L的多聚甲醛固定12h，石蜡包埋。应用TUNEL凋亡检测试剂盒，严格按照原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)说明书进行操作。以已知阳性切片作为阳性对照，在染色过程中用PBS代替TdT反应液作为阴性对照。每张切片于缺血部位随机选取8个高倍视野，分别记数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，并进行汇总，以凋亡心肌细胞数占心肌细胞总数的百分比作为凋亡指数( apoptotic index, AI)，AI=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%。
1.7 Westernblot测定信号蛋白的表达 取心肌的缺血区，置于液氮中冻存后转至-70℃存放。称取冻存心肌样品0.1mg，冰浴，加入500μL组织裂解液[4]，冰浴匀浆，4℃，12000离心10min，收集上清，应用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce, UK)进行蛋白定量。其余样品用4×上样缓冲液稀释，封闭后100℃水浴10min，-70℃保存。以每个样品的总蛋白为20μg上样，进行SDS?PAGE凝胶电泳(浓缩胶为8%，分离胶为12%)，转膜至PVDF(invitrogen)，脱脂奶粉封闭，一抗封闭4℃过夜，二抗37℃孵育1h(羊抗兔)，漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达，自动扫描，进行灰度分析。
1.8 统计学处理 数据均以均数±标准差表示，应用SPSS10.0软件进行数据统计。组间比较应用方差分析，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 芪丹通脉片对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积的影响 芪丹通脉片预处理组缺血再灌注后心肌梗死面积为(28.8±8.4)%，而缺血再灌注组的梗死面积为(49.1±10.3)%，二者之间差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 芪丹通脉片对缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响 在假手术组中，很少有心肌细胞被染色；而在缺血再灌注组和芪丹通脉片预处理组均可见到凋亡的阳性细胞，但后者的凋亡细胞明显减少，其凋亡指数分别为(20.3±4.5)%和(11.6±2.3)%，二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3 芪丹通脉片对PI3K/Akt和Erk信号通路活化水平的影响 通过检测芪丹通脉片预处理对缺血再灌注大鼠心肌PI3K、Akt、pAkt、Erk1/2、pErk1/2表达的影响(图1)，发现芪丹通脉片组中PI3K、Akt、Erk1/2的表达水平与假手术组、模型组中的比较无显著性差异(图2)，但pAkt、pErk的表达明显增加，与模型组比较pAkt、pErk1/2分别增加了2.5倍和1.9倍[(669.7±152.9)au vs.(267.3±94.2)au，P<0.01；(598.8±105.9)au vs.(304.1±87.8)au，P<0.05]。
图1 大鼠心肌PI3K、Akt、pAkt、Erk、 pErk1/2免疫印迹结果（略）
Fig.1 The representative immunoblots of PI3K, Akt, pAkt, Erk, and pErk1/2
Lane A: sham; Lane B: model; Lane C: Qidan Tongmai tablet treatment
图2 PI3K、Akt、Erk蛋白的表达水平（略）
Fig.2 The arbitrary units (au) for the expression level of PI3K, Akt and Erk
Lane A: sham; Lane B: model; Lane C: Qidan Tongmai tablet treatment
3 讨论
凋亡是缺血/再灌注导致心肌损伤、心肌细胞丢失的重要病理机制之一[5]。通过某种方法，减少再灌注心肌细胞的凋亡有助于心肌梗死范围的减小和心肌功能的恢复[6]。 PI3K/Akt和Erk1/2是重要的与心肌细胞存活相关的信号通路，被称为再灌注损伤存活激酶通路(reperfusion injury salvage kinase pathway, RISK pathway)[1]。研究表明，缺血预处理、缺血后处理、胰岛素、胰岛素样生长因子等多种干预方法能够减少缺血再灌注心肌细胞凋亡，抑制心肌损伤；而这些保护方法均能够活化PI3K/Akt[4，7?9]或MEK1/2?Erk1/2[10?12]信号瀑布相关蛋白，募集和磷酸化一系列底物，包括eNOS、参与糖和蛋白代谢调节的GSK3β、GLUT4以及抗凋亡蛋白(Bcl?2、Bad、Bax、Caspase)等，抑制线粒体细胞色素C的释放，阻断凋亡的发生；而当应用特异性信号通路阻断剂抑制PI3K/Akt或Erk1/2及其某些底物磷酸化水平时，则上述的保护作用被减弱；在显性负突变Akt小鼠体内的这种保护作用也被明显抑制[9]。根据以上研究结果，可以推测：通过活化PI3K/Akt和Erk1/2信号通路的介导，某种预处理或后处理措施活化下游抗凋亡分子，能够抑制再灌注心肌损伤。因此，PI3K/Akt和Erk1/2作为新靶点日益受到关注[1,13]。芪丹通脉片能够抑制急性缺血所致的心肌损伤[3]。我们的研究证实芪丹通脉片预处理能够减轻再灌注所致的损伤，缩小心肌梗死的范围，抑制心肌细胞的凋亡，与模型组比较均存在统计学差异(P<0.01)。在芪丹通脉片预处理组，p?Akt，p?ErK1/2表达水平分别增加了2.5倍和1.9倍，与模型组比较差异显著(P<0.01，P<0.05)；但药物灌胃后7d并没有显著改变PI3K、Akt和Erk1/2的表达水平。因此，芪丹通脉片能够提高缺血再灌注心肌Akt和Erk1/2的磷酸化水平，其保护作用可能与PI3K/Akt和Erk1/2信号通路的活化有关。临床缺血/再灌注病理过程的发生，常常存在如冠心病等缺血性疾病基础，术前存在反复发作的病史。缺血导致血流不畅，心肌失于濡养；手术进一步耗气伤血，再灌注后气伤致运血无力。气不足则脉络不通，血行畅则瘀血内阻。因此，在这一病理过程中，“气虚”和“血瘀”两种病理因素并存，相互影响。缺血/再灌注的中医病因、病机可归结为：患病日久，耗气伤血，导致气虚血瘀，脉络不通，心失濡养。根据这一病机，治疗应以益气活血，化瘀通脉为原则。芪丹通脉片的主要成分为黄芪、丹参、红花、当归、桂枝等。方中黄芪、丹参配伍，益气活血并行，化瘀而不耗气伤血，共为君药；当归、红花为臣，补血活血；桂枝为佐使药，辛温通阳，疏通脉络，并兼引诸药归于心经之力。诸药配伍，实现益气活血、化瘀通脉的功效。既往的研究从多方面对该药治疗“瘀血证”的作用机制进行了探讨[14?16]。在本研究中我们发现，该药能够抑制缺血再灌注对心肌细胞的损伤，而这种药理作用没有改变细胞PI3K/Akt和Erk1/2信号通路的蛋白表达水平，而在于改变蛋白激酶的活性，实现抑制细胞凋亡、增强细胞生存能力的作用，进一步体现了该复方遵循的“益气活血”的治疗原则。两条信号通路在细胞内信号转导过程中可能存在“串话”，何种分子的功能改变更能够体现“气”的功能特征，该类分子的活化与益气活血类药物作用机制的相关性尚需要更多的实验证据支持。
基金项目：陕西省中医管理局资助项目(No.2005074)
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[1]Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischemia? reperfusion injury: targeting the reperfusion injury salvage kinase(RISK)?pathway [J]. Cardiovasc Res, 2004, 61(3):448?460.
[2]李晶华,王宗仁,卲中军,等. 芪丹通脉片对实验性急性心肌梗死大鼠心肌的保护作用及其分子机制 [J]. 临床康复, 2004, 8(9):1706?1707.
[3]严晓红，汪长华. 心肌缺血/再灌注损伤模型的制备 [M]. 朱妙章，袁文俊，吴博威,等. 心血管生与临床. 北京:高等出版社, 2004: 633?635.
[4]Gao F, Gao E, Yue TL, et al. Nitric oxide mediates the antiapoptotic effect of insulin in myocardial ischemia? reperfusion: the roles of PI3?kinase, Akt, and endothelial nitric oxide synthase phosphorylation [J]. Circulation, 2002, 105:1497?1502.
[5]Eefting F, Rensing B, Wigman J, et al. Role of apoptosis in reperfusion injury [J]. Cardiovasc Res, 2004, 61(3):414?426.
[6]Scarabelli TM, Gottlieb RA. Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury: old and new concepts after 10 years of contributions [J]. Cell Death Differ, 2004, 11(Suppl 2):S144?152.
[7]Raphael J, Abedat S, Rivo J, et al. Volatile anesthetic preconditioning attenuates myocardial apoptosis in rabbits after regional ischemia and reperfusion via Akt signaling and modulation of Bcl?2 family proteins [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2006, 318(1):186?194.
[8]Zhu M, Feng JH, Lucchinetti E, et al. Ischemic post?conditioning protects remodeled myocardium via the PI3K?PKB/Akt reperfusion injury salvage kinase pathway [J]. Cardiovasc Res, 2006, 72(1):152?162.
[9]Fujio Y, Nguyen T, Wencker D, et al. Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia?reperfusion injury in mouse heart [J]. Circulation, 2000, 101:660?667.
[10]Li DY, Tao L, Liu H, et al. Role of ERK1/2 in the anti?apoptotic and cardioprotective effects of nitric oxide after myocardial ischemia and reperfusion [J]. Apoptosis, 2006, 11(6):923?930.
[11]Darling CE, Jiang R, Maynard M, et al. Postconditioning via stuttering reperfusion limits myocardial infarct size in rabbit hearts: role of ERK1/2 [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289(4):1618?1626.
[12]Hausenloy DJ, Tsang A, Mocanu MM, et al. Ischemic preconditioning protects by activating pro?survival kinases at reperfusion [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 288(2):971?976.
[13]Cannon RO. Mechanisms, management and future directions for reperfusion injury after acute myocardial infarction [J]. Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 2005, 2(2):88?94.
[14]龙铟，王宗仁，马静，等. 芪丹通脉片对大鼠血栓形成及血液粘度的影响 [J]. 微循环学杂志, 2006,16(1):37?39.
[15]王宗仁,李军昌,马爱玲,等. 芪丹通脉片对实验性动脉粥样硬化大鼠单个核细胞细胞间黏附分子?1、血管细胞黏附分子?1 mRNA表达的影响 [J]. 中国临床康复, 2005, 9(27):77?79.
[16]谢娟,王宗仁,王磊,等. 芪丹通脉片对急性心肌缺血大鼠降钙素基因相关肽和内皮素的影响 [J]. 第四军医大学学报, 2006, 27(6):562?564.
