铜绿假单胞菌MexAB?OprM主动外排表型筛选和外排基因检测

          作者：曹敬荣 沈定霞 钱妙玲 罗燕萍 徐雅萍 田芳

【摘要】  目的 研究解放军总临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排系统，为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法 采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸?精氨酸?β萘酰胺)与喹诺酮类抗生素，以微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂时环丙沙星与左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)值，并MIC值的变化，根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上筛选主动外排表型阳性菌株；PCR扩增外排表型阳性菌的耐药基因oprM、mexB和mexR，并对3株菌进行mexR基因测序分析；RT?PCR检测oprM基因的mRNA水平，分析耐药基因的表达情况。结果 苯丙氨酸?精氨酸?β萘酰胺能极大的降低左氧氟沙星和环丙沙星的MIC值，70株多重耐药铜绿假单胞菌中46株表型阳性(65.7%)，其中PCR检测oprM、mexB和mexR基因同时阳性菌株42株(91.3%)，仅oprM基因阳性2株(4.3%)，oprM、mexB和mexR基因均阴性2株(4.3%)。RT?PCR产物测定A值(A260/A280)与PAO1对照阳性菌株13株，以PAO1的oprM/rpoD的A值为对照阳性菌株4株，同时满足A值(A260/A280)和oprM/rpoD比值均高于PAO1的菌株3株。测序结果与GenBank中已知的mexR基因比对，其中2株同源性为100%，1株第434位核苷酸插入2bp(AT)。结论 人民解放军总医院多重耐药铜绿假单胞菌大多存在主动外排的耐药机制，其耐药与外排泵过度表达相关。

【关键词】  铜绿假单胞菌 主动外排 外排泵抑制剂 苯丙氨酸?精氨酸?β萘酰胺 MexAB?OprM RT?PCR

    Detection of the phenotype and genes of active efflux pump

    ABSTRACT  Objective  To study the active efflux pumps of clinical isolates of multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa in PLA hospital and offer the theoretical evidences to clinicians.  Methods  The microdilution method of 96 wells was used to determine the minimum inhibitory concentrations (MICs) of levofloxacin, ciprofloxacin alone and the effect of the presence of efflux pump inhibitor (Phe?Arg?β?naphthy?lamide). Based on the variety of MIC to decrease 8?fold in the presence of PAβN to choose the positive phenotype strains. PCR was used to detect the resistant genes of efflux pumps: oprM, mexB and mexR based on the phenotypic selection. DNA sequencing was adopted to analyze the resistance?related mexR genes for 3 strains. RT?PCR was used to test the levels of mRNA and analyze the expression of the resistance genes.  Results Forty six strains were positive in phenotype tests from 70 multidrug resistant P.aeruginosa (65.7%), and they were used as templates to amplify oprM, mexB and mexR genes. Among them, 42 strains were detected in specific bands of oprM, mexB and mexR simultaneously (91.3%). Two strains were only detected in specific bands of oprM gene (4.3%). However, 2 strains with positive phenotype test showed negative amplification bycomall primer pairs (4.3%). The results of A (A260/A280) and oprM/rpoD for RT?PCR products showed that positive strains were 13 and 4 based on PAO1, respectively. Three strains were positive for A (A260/A280) and oprM/rpoD simultaneously based on PAO1 and DNA sequence results showed 2 strains were 100% homology and 1 strain has a 2bp (AT) insertion in 434 point (GenBank accession number U23763).  Conclusions  Most multidrug resistant strains of P.aeruginosa have active efflux pumps in PLA hospital. The resistant mechanism of P.aeruginosa is associated with the overexpression of mexR gene.

    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  Active efflux;  Efflux pump inhibitor;  Phe?Arg?β?naphthylamide;  MexAB?OprM;  RT?PCR

    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是医院常见条件致病菌之一，临床分离株多重耐药(Multidrug?resistance，MDR)直接影响感染的，因而研究耐药机制指导合理用药是大家关注的热点。研究发现，PA细胞膜上的主动外排泵是导致MDR的主要原因之一。在已经发现的7种外排系统［1］中，MexAB?OprM系统最常见，是一种多重耐药外排泵，对临床多种结构迥异的抗生素具有外排作用，是最具临床意义的外排系统。本试验对临床分离的MDR的PA主动外排表型及MexAB?OprM的基因进行筛选，并检测oprM基因的mRNA表达水平，探讨PA的MDR和MexAB?OprM主动外排泵的分子机制，为临床抗感染治疗提供理论依据，现报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  菌株

    70株临床分离的MDR(均对氟喹诺酮类耐药)的不重复PA菌株作为试验菌株，均由本室自临床标本中分离。质控标准菌株ATCC27853和oprM基因阳性对照菌PAO1，MexAB?OprM突变菌株TNP030#10和过度表达菌株PAO490由日本TaiJi教授惠赠。

    1.2  培养基、试剂和仪器

    M?H(Mueller?Hinton)琼脂培养基，LB肉汤培养基。标准药粉左氧氟沙星(LVLX)、环丙沙星(CPLX)、美罗培南(MRP)、亚胺培南(IMP)(天坛生物制品公司)。外排泵抑制剂(Efflux pumps inhibitor，EPI；苯丙氨酸?精氨酸?β萘酰胺，Phe?Arg?β?naphthylamide，PAβN)、溴化乙锭(EB)(Sigma公司)。Taq DNA聚合酶、DL2000、DL100bp DNA Marker(TaKaRa公司)。RNA提取试剂盒(Promega公司)，SuperScript One?step RT?PCR with platinum (Invitrongen公司)。低温高速离心机、PE480型PCR扩增仪(美国PE公司)、EP6300型电泳装置(北京六一厂)、天能凝胶成像分析系统、恒温水浴振荡器、96孔MIC药敏板(天津金章公司)。

    1.3  PCR引物设计

    自行设计PCR引物，委托上海生物工程有限公司合成序列见Tab.1。

    1.4  MexAB?OprM主动外排表型阳性菌的筛选

    参考文献［2，6］略作修改，用96孔MIC敏感试验板采用微量肉汤稀释法，对70株临床分离的MDRPA进行两组最低抑菌浓度(MIC)检测。接种菌量为105cfu/ml，35℃孵育18～20h后观察结果。根据CLSI/NCCLS(2006年)标准，LVLX的MIC≤0.5mg/L为敏感，MIC≥2mg/L为耐药；CPLX的MIC≤0.25mg/L为敏感，MIC≥2mg/L为耐药。

    第一组分别加入LVLX和CPLX，浓度范围分别为0.125～64mg/L和0.125～32mg/L；第二组分别加入LVLX和PAβN(终浓度为25mg/L)、 CPLX和

    Tab.1        The sequence of primer

    PrimerSequence (5′→3′)    PCR products (bp)GenBank numberReferences  OprMF  CTGAACGTCGAGGCCTTC  OprMR  CTGGATCTTCGCGTAGTCC848AB011381［2］  RT?oprM1  CCATGAGCCGCCAACTGTC  RT?oprM2  CCTGGAACGCCGTCTGGAT180L23839［3］  RpodF  GGGCGAAGAAGGAAATGGTC  RpodR  CAGGTGGCGTAGGTGGAGAA178［3］  MexBF  CAAGGGCGTCGGTGACTTCCAG  MexBR  ACCTGGGAACCGTCGGGATTGA251［4］  MexRF  GGCCGGAACCAGTACACG  MexRR  AATATCCTCAAGCGGTTGC720U23763［5］

    PAβN(终浓度为25mg/L)，LVLX和CPLX浓度范围同第一组。第二组的MIC值降为第一组的1/8(即降低3个稀释度)为主动外排表型阳性。

    1.5  基因检测

    (1)基因组DNA的制备  将待测菌接种于LB肉汤培养基，37℃180r/min振荡孵育20h过夜，取过夜菌1.5ml于12500r/min离心5min，弃上清，加蒸馏水500μl，95℃加热10min，12500r/min离心5min，上清液即为模板DNA。-20℃保存备用。

    (2)PCR扩增  46株主动外排表型阳性菌和PAO1、PAO4290、TNP030#10的oprM基因、mexB基因和mexR基因做PCR扩增(引物见Tab.1)。扩增反应体系为25μl，含有10×缓冲液2.5μl，0.2mmol/L dNTP，0.5μmol/L上下游引物,1.5mmol/L MgCl2，2.0U Taq DNA酶，模板DNA 2μl，用无菌水补足25μl。oprM基因扩增：94℃5min使酶激活，然后94℃ 30s+52℃ 1min+72℃ 2min，30个循环，最后72℃延伸7min。mexB基因扩增94℃ 5min，94℃ 30s+62℃ 1min+72℃ 1.5min， 30个循环，最后延伸72℃7min。mexR基因扩增：94℃ 5min预变性，95℃ 30s+54℃ 45s+72℃ 1min，35个循环，最后延伸72℃ 10min。取PCR产物5μl在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色紫外灯下成像，观察结果。

    1.6  逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT?PCR)

    检测30株外排基因扩增阳性的临床分离菌和PAO1、ATCC27853、PAO4290、TNP030#10的oprM基因mRNA表达水平。

    (1)细菌RNA的提取  接种新鲜培养的PA于5ml LB肉汤培养基，37℃ 200r/min，培养4～6h生长至对数期，取1ml菌液离心收集PA，提取总RNA。总RNA的提取按Promega试剂盒说明书操作，最后通过A分析仪测定RNA的含量及纯度(A260/A280)，置-70℃保存备用。

    (2)RT?PCR程序  按Invitrogen公司One Step RT?PCR试剂盒说明进行操作，2×RT缓冲液25μl，RT?oprM引物0.5mmol/L，0.5μl RNasin(40U/μl)，200U逆转录酶，用无DNA酶、RNA酶的重蒸水补足50μl，于45℃反应30min，50℃反应30min，94℃ 5min预变性，95℃ 30s+54℃ 45s+72℃ 1min，35个循环，最后延伸72℃ 10min。取PCR产物5μl在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色紫外灯下成像，观察结果，并通过凝胶成像分析系统分析RT?PCR产物的相对含量扫描值。用A分析仪测定RT?PCR产物的含量及纯度(A260/A280)。

    1.7  核苷酸序列测定

    mexR基因PCR扩增产物纯化和测序由上海博亚生物工程公司进行，采用ABIPRISM 3730型DNA测序仪测序，结果用EMBOSS软件分析，并与GenBank中已知的mexR基因序列进行比对和同源性比较。

    2  结果

    2.1  主动外排表型阳性菌的筛选结果

    70株PA中在PAβN作用下LVLX的MIC值降至原值1/8的有45株(64.3%)；CPLX在PAβN作用下MIC值降至原值1/8的有8株(11.4%)，其中7株菌同时有LVLX的MIC值降至原值的1/8。将此46株菌(65.7%)确定为主动外排表型阳性菌。LVLX、CPLX单独和与外排泵抑制剂共同作用的MIC值结果见Tab.2。

    2.2  opr、mexB和mexR基因的检测

    上述46株主动外排表型阳性菌中42株(91.3%)同时检测出oprM、mexB和mexR基因；有2株仅扩增出oprM基因而没有mexB和mexR基因，可能携带有其他类型的外排泵，如MexXY?OprM系统等；有2株未扩增出外排基因。表型检测结果表明应用外排泵抑制剂方法筛选主动外排泵与基因扩增结果符合率为95.7%(44/46)，比较可靠。电泳结果见Fig.1。

    2.3  PA临床分离菌株的mRNA表达水平分析

    RT?PCR产物测定A值(A260/A280)与野生株PAO1(1.00534)对照阳性菌株13株，以PAO1的oprM/rpoD的A值为对照阳性菌株4株，同时满足A值(A260/A280)和oprM/rpoD比值均大于或等于PAO1的菌株3株。oprM产物为180bp，rpoD产物为178bp，电泳结果见Fig.2；oprM基因的mRNA表达水平分析Tab.3。

    2.4  测序结果 3株A值表现过度表达菌株的mexR基因扩增产物经自动测序仪测定，均测得719个核苷酸，经EMBOSS软件分析，该序列与GenBank中已知的mexR基因相比，其中2株同源性为100%，无突变；1株第434位核苷酸插入2bp(AT)。

    3  讨论和小结

    铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌之一，在解放军总临床标本中分离率一直居首位［7］，其耐药机制复杂多样，对多数抗生素耐药率不断上升，特别是对亚胺培南、第四代头孢菌素及常用抗假单胞菌药物都耐药的多重耐药PA的出现，给临床有效控制感染带来了很大困难。现在已确定的MexAB?OprM、MexCD?OprJ、MexEF?OprN、MexXY?OprM、MexGHI?OprM、MexVW?OprM和MexJK?OprM外排泵与PA的多重耐药有关［1］。由于MexAB?OprM系统能外排多种临床常用抗生素，如β?内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类等，是近来研究最多也最具临床意义的外排系统［1，3，8，11］。MexAB?OprM系统由外膜蛋白OprM、膜融合蛋白MexA和内膜蛋白MexB三部分组成，三种蛋白的表达均受同一基因mexR的调控，mexR的突变可引起该系统的过度表达而使细菌产生耐药。

    PA外排抗生素的过程是主动耗能过程，能量来源于质子移动力［9］。研究［6，12，13］表明PAαN浓度为20mg/ml时可显著提高PA(包括超表达mex基因和临床分离的野生菌株)对氟喹诺酮类、β?内酰胺类、四环素、红霉素等抗菌药物的敏感性，还能增加细菌细胞膜的通透性，减少临床耐药菌株的产生。本试验以左氧氟沙星和环丙沙星为底物，通过检测在PAβN作用下PA对左氧氟沙星和环丙沙星的敏感性变化，筛选主动外排表型阳性菌株，用PCR方法检测表型阳性的细菌中oprM、mexB和mexR的存在，进而观察MexAB?OprM系统的表达情况，设计保守的看家基因(houskeeping gene)rpoD［14］作为内参照定量检测oprM基因的表达水平。rpoD是δ因子RpoD的编码基因，是一种严格保守的看家基因，它的表达不会因为菌株耐药状况的不同而改变，rpoD基因在生理功能上与外排泵系统无关，在PA基因组序列上与oprM基因不相关。因此从同一菌株中rpoD基因的表达量作为oprM基因表达的参照，来比较不同菌株间oprM基因的表达。

    本实验对临床分离的70株多重耐药的PA研究了在PAβN作用下LVLX和CPLX的MIC值变化情况。从研究结果可看出在PAβN作用下多重耐药菌对LVLX和CPLX的敏感性有明显的提高(Tab.2)；表型检测结果表明应用外排泵抑制剂方法筛选主动外排泵与基因扩增结果符合率为95.7%(44/46)，比较可靠。RT?PCR产物用A分析仪测定A260/A280含量并与看家基因rpoD比较，3株临床分离的PA同时满足(A260/A280)和(oprM/rpoD)A值比PAO1对照菌株高。同时检测过度表达MexAB?OprM外排泵菌株PAO4290和nalB突变菌株TNP030#10的(A260/A280)A值和(oprM/rpoD)A比值，两者均比PAO1对照菌株高，推测此3株菌过度表达外排泵的可能性较大，存在mexR突变的机率较高。将此3株菌送上海博亚生物技术有限公司测序，结果均测得719个核苷酸，经EMBOSS软件分析，该序列与GenBank中已知的mexR基因相比，其中2株同源性为100%，无突变；1株第434位核苷酸插入2bp(AT)移码框。已有研究［5］表明，导致耐药株和其它菌株间外排泵表达差异的原因与抗菌药物诱导作用下其调控基因mexR发生变异有关。其中mexR基因变异位点在第47～57位点、367～377位点有11bp核苷酸缺失，47位T缺失，388位A缺失，69～70位插入C，382～387位6bp核苷酸缺失时与主动外排过度表达相关。虽然本研究中测序结果的突变位点与报告不同，但是结合表型检测结果，此株多重耐药菌的耐药性可能与mexR的突变有关，存在MexAB?OprM主动外排系统的过度表达。2株无mexR突变的多重耐药菌株的耐药性可能与其他耐药机制相关，如外膜通透性的降低(OprD蛋白的缺失)、金属β?内酰胺酶［15］的存在，以及它们和主动外排机制的相互作用等。从主动外排表型、RT?PCR和DNA等测序结果综合分析表明，表型检测方法筛选外排泵可靠和简便。解放军总医院多重耐药PA存在主动外排系统，导致其耐药的原因与主动外排的过度表达相关，而表型检测阳性并没有基因突变菌株的耐药可能与外排泵和其它耐药机制的共同作用有关，它们的相互作用和其它机制有待进一步研究证实。

【】
  ［1］ 曹敬荣，沈定霞. 铜绿假单胞菌多药主动外排系统研究进展［J］. 抗感染化疗杂志，2006，1(2)：135

［2］ 杨维青，谢轶，程曦，等. 铜绿假单胞菌主动外排表型及oprM基因检测［J］. 中华检验医学杂志，2006，29(2)：121

［3］ 金正江，彭少华，李从荣. 铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB?OprM与耐药的关系研究［J］. 中华医院感染学杂志，2004，14(8)：841

［4］ 魏殿军，宋诗铎，马全玲，等. 泵抑制剂对耐喹诺酮类铜绿假单胞菌临床株作用的研究［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(8)：465

［5］ Poole K, Tetro K, Zhao Q, et al. Expression of the multidrug resistance operon mexA?mexB?oprM in Pseudo?monas aeruginosa: mexR encodes a regulator of operon expression ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1996,40:2021

［6］ Kriengkauykiat J, Porter E, Lomovskaya O, et al. Use of an efflux pump inhibitor to determine the prevalence of efflux pump?mediated fluoroquinolone resistance and multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):565

［7］ 罗燕萍，沈定霞，张有江，等. 我院1995～1999年细菌流行分布与耐药监测［J］. 军医进修学院学报，2001，22：217

［8］ 王玉峰，余利岩，杨吉吉，等. 作用于铜绿假单胞菌外排泵的药物筛选模型的建立及初步应用［J］. 中国抗生素杂志，2002，27(1)：6

［9］ 张永，唐英春. 病原菌质子驱动型外排泵分子机制研究进展［J］. 国外医药抗生素分册，2004，25(1)：8

［10］ 李学如，孟涛，王艳. 铜绿假单胞菌耐药机制研究进展［J］. 国外医药抗生素分册，2004，25(3)：105

［11］ Li Xian?zhi. Efflux?mediated multiple antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa ［J］. 中国抗生素杂志，2003，28(10)：578

［12］ Hsu D I, Okamoto M P, Murthy R, et al. Fluoroqui?nolone?resistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors for acquisition and impact on outcomes ［J］. J Antimicrob Chemother,2005,55(4):535

［13］ 杨再昌，杨小生，郝小江，等. 细菌外排泵抑制剂［J］. 中国医科大学学报，2005，36(4)：381

［14］ Savli H, Karadenizli A, Kolayli F, et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real?time quantitative RT?PCR ［J］. J Med Microbiol,2003,52:403

［15］ 曹敬荣. 新发现的获得性金属β?内酰胺酶GIM?1和SIM?1［J］. 国外医药抗生素分册，2006，27(3)：139