新氨基糖苷类抗生素vertimicin的体内抗菌活性研究
作者：李聪然 游雪甫 张伟新 娄人慧 杨信怡 王跃明 陈慧贞 蒋建东
【摘要】 目的 评价新氨基糖苷类抗生素vertimicin(VTM)的体内抗菌活性。方法 采用小鼠全身感染模型，观察VTM对临床分离大肠埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)和金葡菌(S.aureus)腹腔感染小鼠的体内疗效；采用兔皮肤烫伤感染模型、小鼠泌尿道上行性感染模型观察VTM对临床分离大肠埃希菌局部感染的体内疗效，并与对照药进行比较。结果 VTM皮下或静脉给药对E.coli 96?12、K.pneumoniae 93?5、Ps.aeruginosa 94?17和S.aureus 93?44腹腔感染小鼠具有相似的体内疗效，皮下给药的ED50值分别为0.67、0.29、2.41和0.99mg/kg，静脉给药的ED50值分别为0.46、0.23、0.99和1.52mg/kg，体内疗效与奈替米星相近。兔皮肤烫伤感染模型中，VTM各剂量组兔皮肤组织活菌落数明显低于对照组(P<0.05或0.01)。小鼠泌尿道上行性感染模型中，VTM各剂量组肾组织活菌落数明显低于对照组，肾剖面盖印细菌阴性率明显高于对照组(P<0.01)，抗菌活性优于庆大霉素。结论 VTM对全身和局部感染动物均显示较好保护作用，体内疗效与奈替米星相近。
【关键词】 Vertimicin 半数有效量 泌尿道上行性感染 皮肤烫伤感染
In vivo antibacterial activity of a new aminoglycoside antibiotic, vertimicin
ABSTRACT Objective To investigate the in vivo antibacterial activity of vertimicin. Methods The in vivo efficacies of vertimicin were evaluated in mice with experimental systemic infection caused by E.coli, K.pneumoniae, Ps.aeruginosae and S.aureus, skin?burned rabbits infected with E.coli 96?12 and mice transurethrally infected with E.coli 96?12, and compared with those of the control. Results Vertimicin given by s.c. or i.v. had similar effects on mice systemically infected with E.coli 96?12, K.pneumoniae 93?5, Ps.aeruginosae 94?17 and S.aureus 93?44, the ED50s of vertimicin given by s.c. were 0.67, 0.29, 2.41 and 0.99 mg/kg respectively, and those given by i.v. were 0.46, 0.23, 0.99 and 1.52 mg/kg respectively, the in vivo activity was similar to that of netilmicin. In skin?burned rabbits infected with E.coli, and treated with vertimicin were significantly reduced the skin bacteria counts compared to the control (P<0.05 or P<0.01). In mice transurethrally infected with E.coli, the renal colony counts for the vertimicin treated groups were significantly lower than that of the control, and the negative ratios of kidney stamping were significantly higher than that of the control (P<0.01),the activity of vertimicin was better than that of gentamicin. Conclusion Vertimicin had relatively good protection to animals with systemic or local infections, and the in vivo activity was similar to that of netilmicin.
KEY WORDS Vertimicin; ED50; Transurethral infection; Skin?burned infection
Vertimicin(VTM，曾译威替米星)是浙江康乐集团有限公司温州制药厂在verdamicin(VDM)［1］的基础上，通过1?N位乙基化合成的一种新的氨基糖苷类抗生素，与VDM、庆大霉素(GM)、依替米星(ETM)、奈替米星(NTM)同属氨基糖苷类的GM亚组(Fig.1)。氨基糖苷类具有广泛的抗肠杆菌属和其它需氧革兰阴性菌属活性，VTM的体外抗菌活性实验显示其对革兰阴性菌有较强的抗菌活性(与NTM相近)，并且是浓度依赖性的杀菌剂［2］。此外我们还发现其对革兰阳性菌也有一定的体外抗菌活性。本文进一步研究VTM的体内抗菌活性。
Fig.1 Chemical structures of vertimicin and netilmicin
1 材料和方法
1.1 药物及其配制
硫酸VTM(效价538μg/mg，批号20010122)、硫酸VDM(效价550μg/mg，批号20000912)、硫酸ETM(效价614μg/mg，批号200001)和硫酸NTM(效价569μg/mg，批号20000301)均由浙江康乐药业有限公司提供；GM(效价636μg/mg，批号0326?9713)为药品生物制品检定所标准品。药物配制时按实际活性。
1.2 动物
ICR小鼠，外观健康，体重18～22g，雌、雄各半(全身感染)，或体重20～22g，雌性(泌尿道上行性感染)，由北京维通利华实验动物技术有限公司供应，许可证号：SCXK11?00?008。新西兰兔，雄性，体重2.5～3kg，由中国药品生物制品检定所供应，许可证号：2000第07号。
1.3 细菌及其培养稀释方法
(1)实验菌株 用于小鼠全身感染的菌株为大肠埃希菌(E.coli)96?12、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)93?5、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)94?17和金葡菌(S.aureus)93?44；用于兔皮肤烫伤和小鼠泌尿道上行性感染的菌株为E.coli 96?12。所有菌株均为临床分离株，经实验室鉴定后使用。
(2)感染菌液制备
小鼠全身感染 将感染菌分别接种于10ml增菌肉汤(Nutrient No.2，Oxoid，0.5%；Yeast Extract，Oxoid，0.5%，用蒸馏水配制)中，35℃孵育6h，取0.2ml转种于10ml增菌肉汤中，35℃再孵育18h，作为感染原菌液。将原菌液用生理盐水作适当稀释，而后用5%高活性干酵母稀释至感染所需浓度。
兔皮肤烫伤感染 同法制备E.coli 96?12的感染原菌液。将原菌液用生理盐水稀释10倍，得感染菌液，感染浓度为1×108CFU/ml。
小鼠泌尿道上行性感染 将E.coli 96?12置37℃水浴摇床振荡(140r/min)培养过夜，培养液6500×g、4℃离心10min，沉淀用5%高活性干酵母重悬，终浓度为4.4×1010CFU/ml，用于感染。
1.4 实验方法
小鼠全身感染 受试小鼠随机分组，每组10只，雌、雄各半，腹腔注入100%最小致死量(100% MLD)的菌液0.5ml感染，于感染后15min和6h分别皮下或静脉注射给药2次，感染对照不加处理，观察7d内动物死亡数，用Bliss法［3］计算半数有效剂量(ED50)及其95%可信限，进行统计学处理。
兔皮肤烫伤感染 健康新西兰兔，试验前一天背部脱毛。试验当天静脉注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉后，消毒背部皮肤，用自制温控电烫仪(100℃，10s)在兔背部脊柱两侧各2cm处依次致烫伤，共8处，造成深II度烫伤，烫伤面积约为2.54cm2(直径18mm)。烫伤15min后皮内注射0.1ml菌液感染，用自制感染保护罩保护烫伤部位，并用502胶固定。烫伤1h后每个创面用消毒干纱布覆盖并均匀滴加0.4ml受试药液，对照给予同体积的生理盐水，外层用消毒油纱布覆盖以保持创面湿润。给药后24h取创面组织，研磨计数组织活菌落数,用SPSS10.0软件进行统计学处理［4］。
小鼠泌尿道上行性感染 小鼠110只，随机分为11组，每组10只，实验前禁水24h。实验当日将小鼠用戊巴比妥钠麻醉，仰卧于操作板上，尿道口周围皮肤用酒精消毒，然后用5号钝针头经尿道插入膀胱注入菌液0.05ml感染［5，6］。小鼠腹面朝上放入笼中，继续禁水24h。感染后6h初次给药(皮下注射)，以后每天两次，共给药5次。末次给药18h后断颈处死，在无菌条件下取出两侧肾，左肾研磨计活菌落数，右肾剖面盖印，肾组织活菌落数及盖印细菌阴性率，用SPSS10.0软件进行统计学处理［4］。
2 结果
2.1 小鼠全身感染实验
试验结果见Tab.1和Tab.2。VTM皮下或静脉给药得到了相似的试验结果，VTM对E.coli、K.pneumoniae、Ps.aeruginosa和S.aureus感染小鼠均显示较好疗效，皮下给药的ED50值分别为0.67、0.29、2.41和0.99mg/kg，静脉给药的ED50值分别为0.46、0.23、0.99和1.52mg/kg，体内抗菌活性与NTM相近，两者无显著性差异(P>0.05)。对E.coli、K.pneumoniae和S.aureus感染小鼠的保护作用明显优于ETM和GM(P<0.01)，对Ps.aeruginosa感染小鼠的ED50值低于ETM和GM，但无统计学差异(P>0.05)。
2.2 兔皮肤烫伤感染试验
VTM对兔皮肤烫伤并发E.coli 96?12感染具有较好疗效，给药后各剂量组皮肤组织活菌落数明显低于对照组［P<0.05(低剂量组)或P<0.01(中、高剂量组］；ETM、VDM和GM组皮肤组织活菌落数低于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；NTM组皮肤组织活菌落数显著低于对照组(P<0.05)。VTM中剂量(1mg/ml)组皮肤组织活菌落计数明显低于VDM和GM组(P<0.01)；低于ETM组和NTM组，但无显著性差异(P>0.05)，结果见Tab.3。
2.3 小鼠泌尿道上行性感染
VTM对E.coli 96?12泌尿道上行性感染小鼠具有较好疗效，给药后各剂量组小鼠肾组织活菌落数明显低于对照组，肾剖面盖印细菌阴性率明显高于对照组(P<0.01)。GT各剂量组小鼠肾组织活菌落数低于对照组，肾剖面盖印细菌阴性率高于对照组，并且除最低剂量组外，均有显著性差异(P<0.01)，结果见Tab.4。从试验结果可以看出GM组在二倍于VTM的剂量下，肾组织活菌落数高于VTM组，肾剖面盖印细菌阴性率低于VTM组。所以，VTM对E.coli 96?12泌尿道感染小鼠的治疗作用优于GM。
3 讨论
VTM是新的半合成氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类为含有多氨基、多羟基的多价阳离子化合物，主要治疗成分是与氨基环醇类连接的氨基多糖苷。 VTM的体外抗菌活性与NTM相近，并且受低pH和二价金属阳离子的不利影响［2］。
我们对VTM的体内抗菌活性进行了研究。小鼠全身感染试验结果表明，威替米星(包括皮下和静脉给药)对E.coli、K.pneumoniae、Ps.aeruginosa和S.aureus感染小鼠具有较好的保护作用，体内疗效与NTM相近(P>0.05，Tab.1和Tab.2)。对E.coli、K.pneumoniae和S.aureus感染小鼠的保护作用明显优于ETM和GM(P<0.01)，对铜绿假单胞菌感染小鼠的ED50值低于ETM和GM，但无统计学差异(P>0.05)。
兔皮肤烫伤感染实验中，我们用自制的电烫仪先在兔背部致烫伤，再给予一定量的菌液引发感染，较好地模拟了烫伤并发感染的情况，并且可以实现各个伤口烫伤时间、烫伤温度及烫伤皮肤面积的一致性。用该模型进行的研究发现VTM对兔烫伤并发E.coli感染有较好疗效，给药后各剂量组皮肤组织活菌落数明显低于对照组［P<0.05(低剂量组)］或［P<0.01(中、高剂量组)］；ETM、VDM和GM组皮肤组织活菌落数低于对照组，但无显著性差异(P>0.05)；NTM组皮肤组织活菌落数显著低于对照组(P<0.05)。VTM中剂量(1mg/ml)组皮肤组织活菌落计数明显低于VDM和GM治疗组(P<0.01)；低于ETM组和NTM组，但无显著性差异(P>0.05，Tab.3)。
小鼠泌尿道上行性感染实验中，采用在禁水的基础上用5号钝针头经尿道插入膀胱注入菌液感染的方法，与手术暴露膀胱注入菌液感染的方法相比，操作简便、动物痛苦小。不足之处为此方法目前只用于雌鼠，因雄鼠尿道长，从尿道插针进入膀胱不易操作；感染量不准确，因雌鼠尿道短加之禁水膀胱收缩，部分感染菌液从尿道流出。试验结果显示VTM对小鼠泌尿道上行性感染E.coli 96?12具有较好疗效，使小鼠肾组织活菌落数明显降低，小鼠肾剖面盖印细菌阴性率明显升高(P<0.01，Tab.4)，疗效优于GM。
综上所述，VTM在全身感染和局部感染模型中均显示出良好的抗菌活性，与体外抗菌活性试验结果一致。
【】
［1］ Yu P K, Washington J A 2nd. Comparison of in vitro antibacterial activities of gentamicin and verdamycin ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1974,6(4):526
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