3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株耐药机制的研究

            作者：钱洁 宋诗铎 祁伟 王玉宝

【摘要】  目的 研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)对碳青霉烯耐药的分子机制。方法 采用琼脂纸片扩散法(KB法)及微量肉汤法筛选出3株对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌临床株，PCR扩增blaOXA?23基因和测序、提取外膜蛋白及进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)。结果 3株耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌具有多重耐药性；耐药基因PCR扩增和测序证实3株耐药菌均有blaOXA?23基因；其中1株耐药菌AB173的外膜蛋白电泳条带在28.8ku处出现明显缺失，其余2株耐药菌在该条带处与敏感菌相比较无明显差异。结论 本次试验中对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌全部含有blaOXA?23基因，其中一株耐药菌还出现了外膜蛋白孔道的缺失可能与其多重耐药性有关。

【关键词】  鲍曼不动杆菌 多重耐药 blaOXA 23基因 外膜蛋白 聚合酶链反应

    The mechanism of three carbapenem?resistant clinical isolates

    of Acinetobacter baumannii

       ABSTRACT  Objective  To study the molecular mechanism of carbapenem?resistant Acinetobacter baumannnii.  Methods  The carbapenem?resistant strains were detected from clinical isolatesAcinetobacter baumannii by disk diffusion and micro?diluted broth method. The blaOXA?23 gene was amplified by PCR method and then sequenced. Their out membrane proteins (OMP) were extracted and analyzed by using SDS?polyacrylamide gel electrophoresis and a carbapenem?susceptible Acinetobacter baumannnii strain as control.  Results  The PCR amplification and sequencing results showed that the three multi?resiltant Acinetobacter baumannii isolates were multi?resistant and all carried blaOXA?23 gene. The SDS?PAGE electrophoresis result showed that  28.8ku?band deficiency was found in A.baumannii AB173, whereas other two resistant isolates showed the same electrophoresis profiles with the control.  Conclusions  In this experiment, all three carbapenem?resistant Acinetobacter baumannii strains carried blaOXA?23 gene and one of them lacked a 28.8ku OMP, which were probably attributed to the multi?resistance of organisms.

    KEY WORDS  Acinetobacter baumannii;  Multi?resistance;  blaOXA?23 gene;  Outer membrane protein;  Polymerase chain reaction (PCR)

     在过去的几十年内，ICU病房中有创性检查及的增加使得不动杆菌成为重要的条件致病菌，它可以导致广泛的临床并发症，例如肺炎、败血症、泌尿系感染、伤口感染、脑膜炎，尤其易发生在免疫功能低下的患者身上［1］。由于不动杆菌对氨基糖苷类、β?内酰胺类等多种抗生素耐药，因此限制了治疗时对敏感药物的选择，给临床治疗带来了巨大的压力。研究显示鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制涉及产碳青霉烯酶、外膜蛋白(outer?membrane prothin，OMP)缺失、外排泵系统表达亢进和青霉素结合蛋白突变等诸多方面。本试验收集了近期3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株并对其产OXA?23型碳青霉烯酶和外膜蛋白的情况进行研究。

    1  材料与方法

　　1.1  材料

    (1)菌株来源和菌种鉴定  2005年从天津医科大学第二住院患者分离的3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株，标本编号为AB13、AB24、AB173，分别来源于不同患者的痰标本。菌株鉴定采用API20NE(Bio?Merieux)试纸条，对照菌株为对碳青霉烯敏感的鲍曼不动杆菌临床株AB942，质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和嗜麦芽寡养单胞菌临床株Sme006均为本研究室保存。

    (2)试剂  抗生素标准品头孢哌酮(CPZ)、头孢哌酮/舒巴坦(CPZ/SB)购自Pfizer公司；左氧氟沙星(LVLX)、环丙沙星(CPLX)、氧氟沙星(OFLX)、阿米卡星(AMK)、哌拉西林(PIPC)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GM)购自药品生物制品检定所；亚胺培南(IMP)、美罗培南(MRP)和哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)纸片购自中国药品生物制品检定所；头孢曲松(CRO)、头孢吡肟(CPE)、头孢他啶(CAZ)分别购自Rochs公司、Squibb公司、Lilly公司；PCR相关试剂购自上海生工。

    1.2  药物敏感试验

    采用琼脂纸片扩散法(KB法)及微量肉汤法测定MIC值。试验方法及药敏判断标准参照美国临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2005年版的标准。

    1.3  菌体DNA的提取

    细菌基因组DNA参照Pitout JDD方法提取，提取的DNA经A260/A280测定符合质量标准，在-20℃保存。

    1.4  blaOXA?23基因的PCR扩增和序列分析

    采用引物设计软件Primer5.0及Donald等［2］合成引物，上游引物SQ1 5′?GATGTGTCA?TAGTATTCGTCG?3′，下游引物SQ2 5′?TCACAACAACTAAAAGCACTG?3′，预期PCR产物大小为1067bp片断，涵盖了blaOXA?23基因编码序列。PCR反应条件：第一循环变性温度94℃ 240s，退火温度50℃ 60s，延伸温度72℃ 60s；30个循环94℃ 45s，50℃ 60s，72℃ 60s，最终延伸时间360s。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，Quantity?One成像软件进行条带分析，纯化PCR产物送交上海生工测序。

    1.5  细菌外膜蛋白(OMP)的制备

    采用月桂酰肌氨酸钠方法提取OMP［3］，主要步骤如下：取新鲜菌落在30℃ LB培养基中生长过夜，离心后重悬于新鲜的PBS(磷酸缓冲盐溶液)+PMSF(苯甲基磺酰氟)+DTT(二硫苏糖醇)的混合液中，超声细胞粉碎仪在冰水浴中破碎细菌(50W，每次30s)，4℃离心10min，取上清液加入月桂酰肌氨酸钠(N?lauroyl sarcosinate sodium)溶液，20℃孵育30min，超速冷冻离心2h，沉淀用2.2%月桂酰肌氨酸钠溶液洗涤一次，最后将称沉淀悬浮于Tris+EDTA+SDS混合液中为OMP样本液，4℃保存备用。

    1.6  SDS?PAGE分析

    取OMP样本液30μl加入10μl的2×上样缓冲液，100℃煮沸3～5min，同样的方法处理低分子量蛋白分子量标准品。取40μl处理后的混合液用垂直平板电泳仪进行SDS?PAGE，分离胶和浓缩胶的浓度分别是12%和5%。电泳结束后，小心分离凝胶放入固定液中30min，用考马斯亮兰染色过夜，脱色后拍照。采用低分子量蛋白标准品的电泳结果对照。

    2  结果

    2.1  药物敏感试验

    3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床株AB13、AB24、AB173、碳青霉烯敏感鲍曼不动杆菌临床株AB942和大肠埃希菌ATCC25922、嗜麦芽寡养单胞菌Sme006对15种抗菌药物敏感试验结果见Tab.1和Tab.2。

    药敏试验显示AB13、AB24、AB173除对氧氟沙星、左氧氟沙星呈敏感外，对环丙沙星低度耐药，几乎对所有测试的β?内酰胺类和其他抗生素高度耐药；AB926则对全部15种抗生素敏感。

    2.2  blaOXA?23基因PCR扩增及产物序列分析(1)PCR检测  以特异引物SQ1和SQ2扩增包括blaOXA?23基因编码序列在内的DNA片断，结果表明3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌AB13、AB24、AB173都出现一条1067bp大小的PCR阳性产物条带，对碳青霉烯敏感鲍曼不动杆菌菌AB942和大肠埃希菌ATCC25922、嗜麦芽寡养单胞菌Sme006均无此阳性条带(Fig.1)。

    (2)测序结果  3株耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌AB13、AB24、AB173 PCR产物全部进行测序，测序结果在国际互联网上进行BLAST检索分析，与GenBank中blaOXA?23(AJ132105)编码基因序列点同源性为100%，未发现有变异。

    2.3  细菌外膜蛋白的SDS?PAGE分析

    细菌外膜蛋白SDS?PAGE电泳结果显示3株耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌AB13、AB24、AB173与一株碳青霉烯敏感鲍曼不动杆菌AB942相比较，AB173的外膜蛋白在约28.8ku条带处缺失，其余两株AB13、AB24在该条带处与AB926相比无明显差别(Fig.2)。

    3  讨论

    不动杆菌对营养的要求不高，普遍存在于水、土壤、活的生物体内，甚至定植于人的皮肤表面，的洗手池、仪器上都能培养出不动杆菌，因此医院内设备的污染或者医护人员手的交叉传染与医院获得性感染暴发流行有关［4，5］。不动杆菌在医院ICU病房及普通 病房中分离率逐年提高， 其中鲍曼不动杆菌约占70%。近年来多重耐药的鲍曼不动杆菌尤其是对碳青霉烯抗生素耐药的临床株在全世界范围内及我国均不断被报道并研究其耐药机制。鲍曼不动杆菌的多重耐药像其他革兰阴性菌一样由多种耐药机制引起的：①细菌产生β?内酰胺酶破坏抗生素β?内酰胺环结构使药物有效浓度降低而耐药；②靶位耐药(PBPS突变)降低了药物的亲和力而耐药；③膜耐药?外膜孔通道蛋白表达的降低或缺失和主动外排泵系统的亢进使得细胞内有效药物浓度减少而耐药。其中由于外膜孔通道蛋白的非特异性可以导致对β?内酰胺类、氨基糖苷类等多种抗生素的耐药［6，7］。多重耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯等碳青霉烯抗生素耐药主要是产碳青霉烯酶(主要以碳青霉烯抗生素为水解底物的一类β?内酰胺酶)。不动杆菌产碳青霉烯酶主要是Amble分类中的B类和D类：B类酶(金属酶)包括VIM和IMP两大家族，它们需要锌离子介导接触反应的活性，对碳青霉烯抗生素的水解活性较强，目前在鲍曼不动杆菌中发现的金属酶有IMP?2、IMP?4、IMP?5、VIM?1、VIM?2；D类型酶(OXA型酶)在不动杆菌中共发现20余种，分为四组，第一组由OXA?23、OXA?27和OXA?49组成，它们相互区别在于2～5个氨基酸的改变；第二组由OXA?24、OXA?25、OXA?26、OXA?40和OXA?72组成，它们之间有1～5个氨基酸的差别；第三组由OXA?51、OXA?64、OXA?66、OXA?68、OXA?69、OXA?70、OXA?71、OXA?75、OXA?76、OXA?77、OXA?78组成，存在1～15个氨基酸的变异；第四组只有一个OXA?58。以上组内各成员之间的氨基酸同源性≥92.5%，分属不同组的OXA酶之间的氨基酸同源性为40%～70%［8］。据［9］报道，国内耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌80%产OXA?23型碳青霉烯酶。本试验设计了blaOXA?23基因的引物，根据GenBank中blaOXA?23基因和blaOXA?27的对比发现它们的编码区和上、下游序列的同源性高达98%，故使用该引物也可能PCR扩增出blaOXA?27基因，试验结果也表明AB13、AB24、AB173电泳都出现阳性扩增带，经进一步测序发现这3株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌PCR产物序列完全相同并与blaOXA?23基因编码序列一致，因此全部是blaOXA?23基因。而对碳青霉烯敏感的鲍曼不动杆菌AB926则没有该基因，证明OXA?23型酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药的重要原因。根据文献报道碳青霉烯酶对碳青霉烯只是有弱的水解活性(Vmax 0.1%～3%)，因此鲍曼不动杆菌对碳青霉烯的耐药除了有碳青霉烯酶应当还有其他耐药机制联合作用。

    细菌外膜是环绕革兰阴性菌的一种特征性脂质双分子层结构，外层是脂多糖，具有非常有效的通透屏障作用［10］。孔通道蛋白(porin)穿透外膜的内外双层，构成跨膜的扩散通道，只允许亲水性小分子通过进行细胞内外的物质运输及交换，也可以使小分子量的β?内酰胺类抗生素自由通过，因此称为非特异性孔通道蛋白，直接影响到抗生素在细菌中的药物浓度。目前在鲍曼不动杆菌中发现的对碳青霉烯耐药的热点外膜孔通道蛋白集中在21.8、22.3、28.8、32.7～35.7和39.7ku，不同于其他多数革兰阴性菌的“典型”高通透性孔通道蛋白(OmpF、OmpC和PhoE)。本试验检测了AB13、AB24、AB173和AB942的外膜蛋白电泳，结果发现与敏感菌株相比其中1株耐药菌AB173在28.8ku条带处出现了明显的缺失，说明该蛋白与碳青霉烯的耐药可能有关，其余2株耐药菌在该条带处没有明显变化。电泳中使用的SDS使分子内和分子间的氢键断裂从而破坏蛋白的二级和三级结构，使得电泳结果只取决于蛋白分子的大小而不受蛋白电荷及形状的影响，2株耐药菌的电泳条带和敏感菌一样，只是分子量大小无差别并不能说明没有蛋白三级或四级空间结构的改变，而空间结构的改变可以影响孔道的直径，改变对抗生素的通透性，因此并不能完全排除这2株耐药菌没有膜耐药机制的存在。另外，耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌临床株AB173同时存在产OXA?23型碳青霉烯酶和28.8ku大小的膜孔通道蛋白的缺失，但是药敏试验并未发现AB173比AB13、AB24对碳青霉烯的耐药性增高，故膜孔通道蛋白在碳青霉烯耐药中的作用究竟有多大，还需要进一步研究。

    综上所述，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯耐药的重要机制是产OXA?23型碳青霉烯酶，还可能联合外膜孔通道蛋白(28.8ku)表达的缺失。是否还有其他B类或D类碳青霉烯酶及PBP的共同参与耐药，有待于进一步研究。

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