电喷雾离子化多级质谱解析环孢菌素结构

          作者：陈振伟 温耀明 季新燕 郑卫

【摘要】  应用电喷雾离子化多级质谱法分析四种环孢菌素同系物，并对它们的裂解进行分析归纳。在电喷雾离子化多级质谱条件下，环孢菌素先形成N端加质子的［M+H］+分子离子，然后沿肽链的酰胺键发生断裂，产生相应的碎片离子，开环裂解主要发生在2和3位、1和11位以及5位和6位氨基酸残基之间。这一裂解规律可应用于环孢菌素类化合物的快速结构鉴定。

【关键词】  电喷雾离子化 多级质谱 环孢菌素 结构鉴定

    Structural characterization of cyclosporins by

    electrospray ionization mass spectrometry

     ABSTRACT  Electrospray ionization mass spectrometry method was applied to the structural characterization of cyclosporins, the fragmentation patterns and structural assignments of cyclosporins were discussed. Under the experimental conditions, cyclosporins first form ［M+H］+ ion by absorbing a proton on the N atom, then the amide bond split and a series of fragments formed. The main fragmentation pathways started by primary splitting between amino acid residues 2?3,1?11 and 5?6. The corresponding N?terminal b?type ions were common fragment types in the mass spectra. The fragmentation scheme could be used for rapid amino acid sequence determination of cyclosporins.

    KEY WORDS  Electrospray ionization;Mass spectrometry;Cyclosporins;Structural characterization

    环孢菌素是由真菌产生的一组环状十一肽物质，其中环孢菌素A(CsA，Fig.1)已作为重要的免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反应，此外，环孢菌素还具有多种其它重要的生物活性如免疫抑制、抗真菌、抗寄生虫、抗炎、抗HIV、逆转肿瘤细胞多药耐药、I型糖尿病、疟疾、牛皮癣等作用［1～3］。目前已从其最初的产生菌雪白白僵菌(Beauveria bassiana)的代谢物中分离到了二十多个环孢菌素同系物，并在多达17种真菌的代谢产物中分离到各种环孢菌素类化合物［1，4，5］。筛选具有各种生物活性的新环孢菌素同系物已成为当今环孢菌素研发的一个热点，天然和半合成的环孢菌素类化合物已超过800个，因此建立一种可以快速鉴别环孢菌素化学组成的方法显得尤为重要。

    由于环孢菌素类化合物为两端封闭的环状十一肽物质，不能直接用Edman降解法对其十一个氨基酸进行序列分析，因此，早期环孢菌素类化合物的结构鉴定多采用NMR、IR和MS以及x射线晶体衍射等方法进行，并结合强酸水解后测定分子中氨基酸含量的方法最终确定环状十一肽的序列，方法复杂繁琐［6，7］。

    自20世纪80年代以来生物质谱技术在蛋白质和多肽结构鉴定中的应用日趋成熟，对肽键断裂过程的研究表明肽键的断裂主要有b和y两种模式，在b模式中，电荷从N+转移到O+上，离子生成在断裂肽键的C端，形成b离子；在y模式中，电荷不转移，发生氢重排，离子生成在断裂肽键的N端，形成y离子，如Fig.2所示。因此，可以利用质谱技术对短肽进行氨基Cs: A X=H, Y=CH3;  B: X=Y=H;  C: X=OH, Y=CH3;  D: X=Y=CH3;  H (D?MeVal11) CsA

      1993年Vladimír等报道了用快原子轰击(FAB)结合碰撞活化解离(collisionally activated dissociation，CAD)质谱方法分析环孢菌素的氨基酸序列，发现在快原子轰击质谱中先由一个质子加到环孢菌素的某个氨基氮上，形成［M+H］+离子，然后沿肽链的酰胺键(如1和11位氨基酸之间的酰胺键)发生断裂，产生一系列短肽片段离子(即b离子)。对环孢菌素而言，最容易发生断裂的位置为1和11位氨基酸之间(b1?11)，2和3位氨基酸之间(b2?3)以及5和6位氨基酸之间(b5?6)，以环孢菌素A为例，其2和3位氨基酸之间酰胺键断裂的方式如Fig.3所示［9］。

    FAB结合CAD质谱方法能直接判断环孢菌素中十一个氨基酸的序列和组成，为环孢菌素类化合物的结构鉴定提供了一个快捷准确的分析方法。但是，FAB质谱方法还存在一些局限性，如分析过程中需要加入基质；由于采用单一高能量的轰击源(6kV)，会产生许多非选择性，无规律的碎片离子峰，因此无法进行多级质谱(MSn)分析。    20世纪80年代起来的电喷雾离子化(ESI)质谱目前已在天然产物的分子量测定和结构解析中得到广泛应用［10］，其离子化方法属于“软离子化”源，样品分子靠带电液滴产生的库仑排斥力进入气相，不受外部能量激发，因此样品分子一般不发生裂解，在一级质谱图上主要得到分子离子峰，再结合离子阱等技术进行多级质谱分析，将选定的离子加速至合适的动能，通过碰撞诱导解离技术(CID)得到一系列碎片离子。对化合物的碎片离子进行分析归纳，从中得出化合物的裂解规律。本文报道应用电喷雾离子化(ESI)多级质谱分析环孢菌素中氨基酸序列的工作。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    环孢菌素标准品(CsA、CsB、CsC、CsD)均为粉末，由福建省微生物研究所提供，它们的氨基酸组成和分子量见Tab.1；甲醇、色谱纯为Merck公司生产；甲酸和分析纯为联试化工试剂有限公司产品。

    1.2  实验仪器

    美国Agilent公司1100?SL型离子阱质谱仪(MSD Trap)。

    1.3  实验方法

    (1)样品制备  将适量CsA、CsB、CsC、CsD标准品分别溶解于含有0.1%甲酸的甲醇溶剂中，置4℃冰箱保存备用。

    (2)多级质谱条件  采用直接进样法对样品进行电喷雾电离多级质谱分析。电喷雾离子化源(ESI源)；极性检出模式为正模式(MS+)；毛细管电压4000V；干燥气(N2)流速5.98L/min；干燥气温度300℃；雾化气压力20.00psi；裂解器电压1.1～1.5V；最大积聚时Fig.3    Cleavages between amino acid residues 2?3 in CsA under FAB/CAD conditions

    间300ms；目标(ICC Target)30000；全程扫描时间2～3min；扫描范围：50～1400m/z。

    2  结果与分析

    2.1  实验结果

    在实验条件下，对质荷比范围50～1400的离子进行多级扫描，获得样品三级质谱图(以CsB为代表，Fig.4～7)。在一级质谱图中主要得到CsB的［M+H］+分子离子，在二级和三级质谱图中主要得到［M+H］+分子离子经碰撞诱导解离技术(CID)得到的一系列b型碎片离子，质谱图中观察到的主要碎片离子分别归纳列于Tab.2～4。

    2.2  分析与讨论

    (1)环孢菌素在电喷雾离子化质谱中的裂解与在FAB中的相同，即主要产生b型碎片离子，由于采用低能量的离子化源，与FAB/CAD方法比较，可以应用电喷雾离子化多级MS/MS技术得到更多的有规律裂解的碎片离子，如对b5?6碎片离子而言，在电喷雾离子化多级质谱中可以检测出一系列的碎片离子(Tab.4)，而在FAB/CAD质谱中只检测出b65?6、b55?6和b45?6。因此，应用电喷雾离子化多级质谱分析环孢菌素，能得到更多的氨基酸序列信息。

    (2)环孢菌素是由11个氨基酸组成的环状结构，故理论上有11种不同的裂解方法。但通过对质谱图的分析发现2位和3位间、1位和11位间、5位和6位间的裂解是主要的裂解方式，质谱图中观察到的大部分碎片离子峰都是由这3种裂解方式通过有次序的脱去氨基酸所产生的(Fig.2～6，Tab.2～4)。由于不同的裂解方式产生的碎片离子不尽相同，因此可以根据质谱图中出现的碎片离子峰推导出环孢菌素的氨基酸序列。

    (3)对分子中存在羟基的环孢菌素，FAB/CAD质谱中出现［MH?OH］+峰，而在电喷雾离子化多级质谱中只出现［MH?H2O］+峰，因此很容易根据脱水峰的碎片离子判断化合物中羟基的数目，如环孢菌素C含两个羟基，在质谱图中出现很明显的两个脱水后的碎片离子峰(Tab.2～4)。

    (4)根据电喷雾离子化多级质谱中的［MH?H2O］+峰可以进一步分析确定环孢菌素中的氨基酸序列，以环孢菌素A为例，如开环裂解方式为b1?11(1位和11位间开环裂解)时，因1位上含羟基的特殊氨基酸MeBmt位于链状结构的末端(Fig.8)，所以此途径产生的碎片离子均含有MeBmt，也就可以形成相应的［bn1?11?H2O］+。b2?3开环裂解方式(Fig.3)中，b92?3以下均不含MeBmt，因此不产生相应的［bn2?3?H2O］+。同理，b5?6开环裂解方式(Fig.8)中，b65?6以下不产生相应的［bn2?3?H2O］+。因此根据碎片离子的脱水情况可以基本确定含羟氨基酸基所在的位置。

    (5)在FAB质谱分析中，Vladimír等根据图谱中出现［MH?113］+离子峰的情况推测这可能是1位上特殊氨基酸MeBmt侧链发生裂解后产生的离子峰［MH?C7H13O］+，也可能归属于b110?11［MH?MeVal］+或其它裂解方式产生的碎片离子峰，在本实验中，根据3种断裂方式均产生含MeBmt的碎片离子结果，可以确定［MH?113］+碎片离子峰应为b110?11［MH?MeVal］+。

    3  结论

    由于采用了“软离子化”源的电喷雾离子化多级质谱，环孢菌素开环裂解得到的多级碎片离子峰比FAD/CAD方法更丰富，更有规律，可以用2位和3位间、1位和11位间、5位和6位间氨基酸的开环裂解方式来分析判断，为已知和未知的环孢菌素类化合物的快速排查和鉴定提供了一个简捷准确的分析方法，将在环孢菌素的研发中发挥重要的作用。