正交实验优化牛蒡子的提取工艺
作者：卢来春，张蓉，周世文，蒋学文
【关键词】 牛蒡子；牛蒡苷；正交设计
［摘要］ 目的：优选牛蒡子乙醇提取的最佳工艺。方法：采用L9（34）正交试验筛选醇提工艺条件，用HPLC法测定牛蒡苷的含量。结果：牛蒡子的最佳醇提条件为：乙醇浓度70％，加8倍溶剂量，回流3次，回流时间1 h。结论：采用本工艺牛蒡子的活性成分牛蒡苷提取率达95.43%，工艺可行。
［关键词］ 牛蒡子；牛蒡苷；正交设计
Optimization of the technology of extracting chemical constituents from fructus arctii by orthogonal experimental design
［Abstract］ Objective:To optimize the technology of extracting chemical constituents from fructus arctii. Methods: HPLC was used to analyze the content of Arctinin, and the L9 (34) orthogonal experimental design was used to optimize the conditions of the ethanol extraction technology. Results: The conditions of the ethanol extraction technology of extracting the constituents from Fructus arctii were 70 % ethanol, 1 hour of reflux, 8fold solvent and 3 times of extraction. Conclusions: With the extraction rate of arctiin as 95.43%, the optimized technology is stable and practical and worthy of a trial in pharmaceutical production.
［Key words］ Fructus arctii; Arctinin; Orthogonal experimental design
牛蒡子为菊科植物Arctium lappa L.的果实，味辛、苦，性凉，其富含牛蒡苷（arctinin）、牛蒡苷元（arctigenin）等成分。医学研究表明：牛蒡子醇提物有降血糖的作用，且效果确切［1，2］。目前，临床上还没有专门供糖尿病儿童患者使用的降糖药物。牛蒡子为传统中药，毒副作用非常低，我们拟将其开发成供儿童用的糖尿病治疗药物，采用正交设计，以牛蒡苷为指标，优选出牛蒡子乙醇回流法的提取条件，为牛蒡子的化生产作研究。
1 仪器与材料
岛津LC10AT高效液相色谱仪（日本）；牛蒡子药材为菊科植物Arctium lappa L.的果实（购自重庆桐君阁中药批发有限责任公司，生产厂家为宜宾中药饮片厂，产地四川，批号050901，由重庆市药检所鉴定）；牛蒡苷对照品（购自药品生物制品检定所，批号110819-200404，供含量测定用）；重蒸水自制，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 含量测定方法
2.1 色谱条件［3］DiamonsilTM ODS C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇∶水（1∶1.1）；测定波长280 nm；流速1 mL/min；进样量10 μL。
2.2 对照品溶液的制备精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥24 h的牛蒡苷对照品13.92 mg，精密称定，置25.0 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为556.8 μg/mL的牛蒡苷对照品贮备液，于冰箱4 ℃保存备用。
2.3 线性范围考察分别精密量取对照品贮备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件，进样10 μL，记录色谱图，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=36369+211719.6C，r=0.9993，线性范围为0.557～4.456 μg。
3 牛蒡子提取方法的选择
各取牛蒡子药材100 g，石油醚脱脂后，分别按水煮、水煮醇沉及70%乙醇回流提取法处理（加溶媒量8倍，提取时间1 h，提取两次），浓缩，以牛蒡苷含量为指标测定，结果见表1。由表1可知，70％乙醇回流提取牛蒡苷效果最好。
表1 不同提取方法牛蒡苷含量的比较 略
3.1 醇提正交实验
3.1.1 因素水平的确定 根据醇提法的常规，选择了乙醇浓度、回流次数、提取时间、溶媒用量为考察因素，每个因素选三个水平，以牛蒡苷含量为考核指标，按L9（34）正交实验表设计实验，其正交实验因素水平表见表2。
表2 因素水平表水平 略
3.1.2 正交实验方法 称取牛蒡子适量，石油醚脱脂后，分别按正交因素表制备各样品，滤过，浓缩至每毫升含0.5 mg牛蒡子，并精密吸取各正交实验样品1 mL，挥去乙醇，分别用甲醇溶解至2 mL，摇匀，滤过，备用。
3.1.3 牛蒡苷含量测定 分别吸取上述各样品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定牛蒡苷的含量，结果见表3，方差分析见表4。
表3 正交试验安排表及试验结果（略）
表3可知，因素C的极差最小，数据处理时作为最小误差项。由表4值可知，各因素对牛蒡子醇提工艺影响的程度依次为：B、A、D、C，即因素B对牛蒡子醇提工艺有较大影响，因素A其次，因素D再次之，而因素C的影响不大。根据直观分析，乙醇浓度90%，回流提取3次，每次2 h，加8倍溶剂量为最佳工艺，但是为了节省大生产成本和操作的方便，选定了牛蒡子醇提工艺为：A2B2C3D2，即乙醇浓度70％，回流3次，回流时间1 h，加8倍溶剂量。
表4 方差分析表误差来源 略
3.1.4 验证实验 称取牛蒡子500 g，共计3份，石油醚脱脂后，每次加8倍70％乙醇，每次1 h，回流3次，重复3次，测定牛蒡子中牛蒡苷的含量，试验结果见表5。结果表明，采用本工艺牛蒡苷收率较高，重现性好，工艺稳定，成本较低，满足大生产的要求。
表5 牛蒡子醇提验证实验结果 略
4 讨论
牛蒡苷是牛蒡子的主要成分之一，具有很强的药理作用，故本研究选择牛蒡苷的含量作为醇提正交工艺研究的评价指标。根据国家食品药品监督管理局的要求，在新药研究中应根据药物的理化性质对药材的提取工艺进行优化，以确保有效成分充分提尽，达到去粗取精的目的。因素C对醇提工艺的影响最小，故采用回流1 h工艺，以节省生产成本。本试验表明，乙醇浓度70％，回流3次，回流时间1 h，加8倍溶剂量为牛蒡子提取稳定可行的最优工艺。
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［1］ 徐朝晖, 李 婷, 邓 毅, 等. 牛蒡子提取物的降血糖作用［J］. 中草药, 2005, 36(7): 10431045.
［2］ 王海颖, 陈以平. 牛蒡子及其提取物对大鼠肾皮质糖基化终产物的影响［J］. 上海中医药大学学报, 2004, 18(3): 4851.
［3］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)［S］. 2005年版. 北京: 化学出版社, 2005: 4849.
