更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bcl

【关键词】  更年平调液；,,心肌；,,更年期大鼠；,,bcl

　　摘  要：  目的： 探讨更年平调液对更年期大鼠心肌细胞保护作用的机制。方法： 选用鼠龄为11～15个月的更年期雌性SD大鼠共40只, 随机分为4组,即更年平调液组(P组)、更年期对照组(M组)、乙烯雌酚组( E组)及更年康组(G组) ,每组10只。另选鼠龄为4～6 个月,体重130～180 g的SD大鼠10只,为青年对照组(Y组)。实验第45d,采用免疫组织化学方法检测各组心肌组织中Bcl2的表达水平，利用机图像分析技术测量各组心肌组织中Bcl2表达的平均光密度和平均阳性面积。结果：更年平调液组与更年期对照组、乙烯雌酚组及更年康组之间，Bcl2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），更年平调液组与青年对照组比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。结论： 更年平调液能抑制心肌细胞凋亡而对心肌细胞起着重要的保护作用。

　　关键词：  更年平调液；  心肌；  更年期大鼠；  bcl2；  凋亡；  免疫组织化学   

　　更年期综合征即祖国医学的绝经前后诸症,是更年期妇女发病率最高的一种病症，多发于45～55岁妇女。更年期综合征是妇女进入更年期，卵巢功能开始衰退后出现的病症。临床表现除月经紊乱外,还有烘热出汗、胸闷烦躁、头昏心慌、失眠多梦或精神抑郁、焦虑忧愁等一系列症候群［1，2］。更年期平调液经多年临床应用已证实能明显改善更年期妇女的心血管症状,减慢心率,改善心室功能［1,2］，但作用机理尚未阐明。本研究则采用免疫组织化学方法,观察了平调液对更年期大鼠心肌组织内bcl2的表达，以此研究更年平调液对更年期大鼠心肌保护作用的机理。

　　1  材料与方法

　　11  动物分组及处理选用鼠龄为11～15个月的自然更年期雌性SD大鼠, 体重250～350g,并经阴道细胞涂片,证实属更年期者共40只,作为本研究的实验模型。40只更年期动物随机分为4组：即更年平调液组(P组) 、更年期对照组(M组) 、乙烯雌酚组(E组) 及更年康组(G组) ,每组10只。另选鼠龄为4～6个月,体重130～180 g的SD大鼠10只,为青年对照组( Y组)。各组动物处理如下：①更年平调液组：更年平调液制剂(W／V =180 %) ,20 ml／kg 体重,相当生药30 g／kg 体重,每日一次灌胃,连续45 d；②更年期对照组：生理盐水灌胃,20 ml／kg体重,用法同前；③乙烯雌酚组：乙烯雌酚片剂溶于水,浓度为1. 25 g／L ,用量为20 ml／kg体重,用法同上；④更年康组:更年康片剂溶于水,成3 %浓度,用量为20 ml／kg体重,相当生药0. 6 g／kg体重；⑤青年对照组:处理方法同更年期对照组。实验结束后,取各组心肌组织做免疫组织化学实验。

　　12  实验用药剂①更年平调液由枸杞、肉芙蓉、制首乌、女贞子及龙齿等12 味中药组成,由武汉大学中南药厂配制成180 %(W/ V) 制剂；② 更年康片:为石家庄新华制药厂产品,批号9005112 ；③乙烯雌酚片:为广州济光制药厂产品,批号900803 。

　　13  免疫组织化学

　　131  主要试剂  ① 浓缩型鼠抗人Bcl2单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；② 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）；③ DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　132  主要仪器  YWY781型医用微波仪（250W，50Hz），浙江临安器材厂生产；家用高压锅。

　　14  方法

　　141  免疫组织化学SP法检测Bcl2相关抗原
主要步骤：① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ Bcl2采用微波抗原修复（3档，10 min），PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（Bcl2，1:50)37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为Bcl2的阳性对照组。

　　142  免疫组织化学结果判断Bcl2胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Bcl2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）

　　143  统计学处理对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。

　　2  结果

　　21  Bcl2的表达更年平调液组心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒密集，Bcl2呈强阳性表达；更年期对照组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒，Bcl2无表达；乙烯雌酚组及更年康组胞浆内棕黄色颗粒较少，呈弥散分布，Bcl2呈弱阳性表达；青年对照组心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒密集，Bcl2呈强阳性表达。图像分析结果见表1。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，更年平调液组与更年期对照组、乙烯雌酚组及更年康组之间，Bcl2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01)，更年平调液组与青年对照组比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。

　　表1  更年平调液对更年期大鼠心肌细胞Bcl2表达的平均光密度和阳性面积率（略）   

　　3  讨论

　　妇女一般在45～ 52岁之间, 平均48岁左右,月经便停止。在月经将绝未绝的1～ 2年间,出现的植物神经系统、内分泌系统功能紊乱为主的临床证候群，主要表现为阵发性烘热, 热后出汗, 汗后畏寒, 或夜间盗汗, 常伴胸闷心悸、烦躁、易怒、眩晕、忧郁、精神萎靡等症状, 统称为更年期综合征。女性更年期卵巢功能逐渐减退,体内性激素水平逐渐减低［3］。在此时期,部分妇女由于性激素减少引起骨质疏松以及因植物神经功能紊乱而产生心血管、生殖器官等症状。突出表现为心血管功能不稳定［4，5］ 。中医学理论认为,更年期综合症是由于肾气渐衰,精血不足,冲任脉亏损而致的阴阳平衡失调,对于此症,用补肾法效果甚佳［6，7］ 。细胞凋亡(apoptosis)［8］是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。它是细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的死亡。细胞凋亡的过程不导致溶酶体及胞膜的破裂，没有细胞内涵物外泄，所以不引起炎症反应。bcl2基因是1984年由Tsujimoto［9］等从滤泡性B细胞淋巴瘤中分离出来的一种原癌基因。Vaux等［10］首先报道，bcl2基因可明显延长细胞的存活时间，但并不促进细胞的增殖。而后的研究发现，bcl2基因可抑制多种组织细胞的凋亡，故将其称为凋亡抑制基因。bcl2基因并不像其他癌基因那样加速细胞分裂，它的作用是通过抑制细胞凋亡来延长细胞的寿命。bcl2基因表达产物Bcl2是一种分子量为26kD的蛋白，主要存在于线粒体膜、核膜和内质网膜上。在其氨基酸的C末端有一由9个氨基酸组成的疏水性片断，并借此与膜相连。Bcl2蛋白羧基端的跨膜区域对Bcl2蛋白发挥抑制凋亡功能起决定性作用。bcl2基因通过编码Bcl2蛋白而发挥抗凋亡作用，具体机制可能是：①Bcl2蛋白位于线粒体上，通过抑制氧自由基的产生或起一种抗氧化剂的作用，而产生抗凋亡作用［11］；②细胞凋亡中DNA的消化需要相关的Ca2+依赖性核酸内切酶参与，Bcl2通过阻断Ca2+从内质网释放实现对细胞凋亡的抑制［12］；③细胞凋亡时伴有细胞内细胞色素C（cytochrome c）减少及线粒体内细胞色素Ｃ增加，而Bcl2主要定位于线粒体上，Bcl2可能通过影响线粒体释放细胞色素C的过程来调节凋亡［13］。本实验用更年平调液给更年期大鼠灌胃,经免疫组织化学方法显示, 更年平调液组心肌细胞Bcl2呈强阳性表达；更年期对照组心肌细胞Bcl2无表达；乙烯雌酚组及更年康组Bcl2呈弱阳性表达；青年对照组心肌细胞Bcl2呈强阳性表达。经q检验，更年平调液组与更年期对照组、乙烯雌酚组及更年康组之间，Bcl2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01)，更年平调液组与青年对照组比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。实验结果说明乙烯雌酚可补充更年期卵巢功能衰退时雌激素的不足。更年康的作用是扶正固本,益气健脾及补肾安神,为市售成药,用于更年期心血管症状。乙烯雌酚组或更年康组与更年期对照组比较,差别也有显著性(P<0.05) ，表明乙烯雌酚和更年康对更年期大鼠心肌细胞起一定的保护作用,但更年平调液对更年期大鼠心肌细胞的保护作用优于乙烯雌酚和更年康,因更年平调液中的枸杞、肉芙蓉、制首乌及女贞子具有补肝肾、益精血、调冲任之功效,龙齿能平肝潜阳,镇静安神,诸药合用使肝肾之阴得补,阳亢得抑,其目的是使“阴平阳秘”,以平为度。并且在中医学理论中,心为火,肾为水,水火相济,心肾功能方能维持平衡,因此可用补肾法来调节心脏功能。更年平调液抑制细胞凋亡，维持细胞存活的作用，对心肌细胞起着重要的保护作用。

　　参  考  文  献

　　1  中华医学会消化学分会肠易激综合征共识意见. 中华消化杂志,2003，23 (7) :427~428.

　　2  中华人民共和国卫生部. 中药新药治疗肝郁脾虚证的临床研究指导原则. 中药新药指导原则, 1993，96.

　　3  中华人民共和国卫生部 中药新药治疗泄泻的临床指导原则. 中药新药指导原则, 1993，127~128.

　　4  熊舜华,程化奇,殷新尤,等. 更年平调液对更年期大鼠作用的实验研究. 湖北医科大学学报,1994,15(1) :72.

　　5  徐江. 大鼠更年期综合症心功能变化的探讨. 武汉医学杂志,1993，1 :19.

　　6  徐澄. 补肾宁片治疗更年期综合症92 例近期疗效分析. 山东中医学院学报,1985,9 (2) :9.

　　7  陆启滨,夏桂成,陈丹华,等. 更年新方治疗更年期综合症的临床观察. 中西医结合杂志,1991,11 (9) :535.

　　8  金惠铭，卢建，殷莲华，主编. 细胞分子病理生. 郑州：郑州大学出版社，2002，369~370.

　　9  Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t (14:18) chromosome translocation. Science, 1984, 226 (4768): 1097~1099.

　　10  Vaux DL, Cory S, Adams JM. Bcl2 gene promotes haemopoietic cell survival and cooperates with cMyc to immortalise preB cells. Nature， 1988, 335(6189): 440~442

　　11  Hockenbery DM, Oltvai ZN, Yin XM, et al. Bcl2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell， 1993 75(2): 241~251.

　　12  Lam M, Dubyak G, Chen L, et al. Evidence that Bcl2 represses apoptosis by regulating endoplasmic reticulumassociated Ca2+ fluxes. Proc Natl Acad Sci USA， 1994, 91(14): 6569~6573.

　　13  Kluck RM, BossyWetzel E, Green DR, et al. The release of cytochromec from mitochondria: a primary site for Bcl2 regulation of apoptosis. Science, 1997, 275(5303):1132~1136.