促凋亡基因bad在皮肤血管瘤组织中的表达
【关键词】 bad；,,血管瘤；,,凋亡；,,免疫组织化学,,,,
摘 要： 目的：探讨促凋亡基因bad在皮肤血管瘤中的表达及其与临床的关系。方法：采用免疫组织化学方法检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织中bad的表达水平，利用机图像分析技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织bad表达的平均光密度和平均阳性面积。结果： 图像分析结果显示,增生期组的平均光密度为0.0496±0.0152；退化期组的平均光密度为0.1751±0.0349；正常皮肤组的平均光密度为0.0524±0.0164。增生期组的阳性面积率为0.1047±0.0103；退化期组的阳性面积率为0.2943±0.0371；正常皮肤组的阳性面积率为0.1103±0.0132 。经q检验，退化期组与增生期组、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01）, 增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05）。结论： bad通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。
关键词： bad； 血管瘤； 凋亡； 免疫组织化学
血管瘤是婴幼儿最常见的一种良性肿瘤，其发病率约为10%，男女比例为1:3。目前成人病例也不少见。这种良性肿瘤在婴幼儿出生后通过内皮细胞的增生而快速生长，虽然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤。如果位于颜面、颅内及口腔可引起明显的畸形及功能障碍，持续则可产生溃疡、出血、感染等一系列并发症；位于颜面及口腔的血管瘤可引起明显的外观畸形及功能障碍，严重影响患者的身心健康。临床手段主要包括：手术切除、冷冻、栓塞、硬化剂注射治疗、激素、干扰素治疗、各种激光治疗等［1,2］。这些治疗手段普遍存在损伤大，有一定副作用等缺点。不但效果欠佳而且给病人带来极大痛苦。如皮质激素被认为是治疗血管瘤的首选药物，对增生期血管瘤有效率为30%~90％［3］，但是同时它存在的副作用有延迟骨架生长、损害机体的免疫能力等［4］。因此寻找一种有效的治疗手段对血管瘤患者有重要意义。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。促凋亡基因bad是bcl2家族中的一员,其对血管瘤的发生、发展及其退化的研究尚未见报道。为此我们应用免疫组织化学方法和图像分析技术检测血管瘤增生期、退化期以及正常皮肤组织中bad的表达水平，以探讨bad基因在血管瘤发生、发展过程中的作用机制。
1 材料与方法
11 材料
111 材料来源 收集武汉大学人民病理科2002~2006年皮肤血管瘤存档蜡块50例，其中男性25例，女性25例。血管瘤所在的部位主要有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性治疗。
112 材料分组 蜡块切片厚5μm，贴片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上，置于烤箱烤干待用。常规HE染色和免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组：增生期血管瘤22例，退化期血管瘤28例。另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。
12 主要试剂和仪器
121 主要试剂 ① 即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；② 即用型兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；③ 浓缩型鼠抗人bad单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；④ 超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；⑤ DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。122 主要仪器 YWY781型医用微波仪(250W，50Hz)，浙江临安器材厂生产；家用高压锅。
13 方法
131 常规HE染色 取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。
132 免疫组织化学SP法检测bad、PCNA和Ⅷ因子相关抗原 主要步骤：① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ bad采用微波抗原修复（3档，10min），PCNA采用高压抗原修复，Ⅷ因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（bad，1: 150；)37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照，人扁桃体作为bad的阳性对照，人正常皮肤表皮作为PCNA的阳性对照。
133 免疫组织化学结果判断 bad和Ⅷ因子相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，PCNA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对bad的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）
134 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。
2 结果
21 PCNA的表达增生期血管瘤内皮细胞核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA表达强。退化期血管瘤内皮细胞核被苏木精染成蓝色，胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA表达弱。
22 Ⅷ因子相关抗原的表达增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。
23 bad的表达退化期血管瘤内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒较多；增生期血管瘤内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内无棕黄色颗粒。图像分析结果显示：增生期组的平均光密度为0.0496±0.0152；退化期组的平均光密度为0.1751±0.0349；正常皮肤组的平均光密度为0.0524±0.0164。增生期组的阳性面积率为0.1047±0.0103；退化期组的阳性面积率为0.2943±0.0371；正常皮肤组的阳性面积率为0.1103±0.0132 。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，退化期组与增生期组之间、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。
表1 血管瘤不同时期bad表达的平均光密度和阳性面积率（略）
3 讨论
血管瘤是最常见的良性肿瘤之一，在婴幼儿中发病率较高，新生儿的患病率为1.1%~3.8%，至1岁时可高达10%。血管瘤可发生于身体各处，尤以头颈部多见，但也见于内脏。其病程经历增生期、退化期和退化完成期三个阶段。病理组织学上，增生期血管瘤表现为内皮细胞核肥大、内皮细胞过度增殖，形成含有毛细血管大小的管腔或无腔的肿块；退化期血管瘤表现为内皮细胞数量减少，内皮细胞核变扁平，血管腔扩大、血管壁薄，血管之间结缔组织增多；至退化完成期，可遗留色素沉着、毛细血管扩张、间质纤维化和脂肪组织沉积。目前为止，关于血管瘤发生、及退化的机制尚未完全明了。已有的研究发现，增生期血管瘤组织中多种血管形成因子呈高表达，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）［5］、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）［6］；雌激素受体呈高表达［7］；增生期血管瘤组织中肥大细胞的数量较正常组织高很多，而退化期血管瘤组织中肥大细胞数量减少，至退化完成期肥大细胞数量可恢复正常［8］。另外，有报道血管瘤的发生以及退化还与内皮细胞的增殖与凋亡的不平衡有关［9］。细胞凋亡（apoptosis）是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程。血管瘤自发消退的过程中无炎症反应，无组织坏死，非常符合凋亡的过程，因此许多研究者推测可能是由于增殖的血管内皮细胞凋亡导致血管瘤自发消退。Iwata［10］等证实了血管瘤组织中存在较高的细胞凋亡率。Razon等［11］报道应用TUNEL法测定，发现在增殖期血管瘤中细胞凋亡水平低，而在退化期血管瘤中凋亡水平则升高5倍，免疫荧光双标记实验表明至少三分之一的凋亡细胞是内皮细胞。程立新等［12］报道Bcl2这一凋亡抑制因子在海绵状血管瘤及蔓状血管瘤组织中的表达较毛细血管瘤中的表达高。根据我们实验室的多年研究及报道，依据血管内皮细胞的生物学特点并结合临床，将传统的命名血管瘤分为血管瘤和血管畸形。毛细血管瘤是属于血管瘤类型，而海绵状血管瘤和蔓状血管瘤属于血管畸形，因此可以推测为什么血管瘤会自发消退而血管畸形却不会消退。bad 是首先从鼠的cDNA文库克隆鉴定出的促凋亡基因,其后又克隆出人的同源基因,它属于bcl2家族成员。双杂交和序列分析显示,bad与bcl2和bclxL结合,具有促进凋亡作用,故名bad ( bclxL/ bcl2associated death promoter) ,它存在bcl2家族成员BH3同源结构域和序列。与bax、bak、bcl2和bclxL相似,BH3结构域是bad与bcl2家族蛋白结合所必需的,突变的bcl2和bclxL不能与bax、bak 结合,而bad却可以与它们结合［13，14］ 。过去已知bad的促凋亡作用依赖于与bcl2 或bclxL结合,bad 必须与bclxL结合诱导凋亡,细胞外的bad 通过与一种细菌毒素的转运结构域结合进入细胞, 诱导凋亡。最近Hong等［15］发现,bad在某些病毒感染时可与病毒受体结合,可能通过酪氨酸激酶途径激活细胞凋亡。因此, bad作为调控细胞凋亡的重要成员,其在肿瘤中的研究一直受到重视。bad在多种肿瘤中的表达具有重要的意义。Ichinose 等［16］发现,bad蛋白磷酸化后失活,失活后的bad 可加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化。Kohler等［17］则发现,bax和bad的高表达与急性白血病的预后不良相关,可以作为一个预后指标。在bcl2和bclxL过表达的情况下,bad可直接诱导凋亡,具有意义［18］ ; 在直肠癌组织中,bad、bcl2的异二聚体减少有助于癌的进展,促凋亡的bax和bad与抗凋亡的bcl2和bclxL竞争性结合形成二聚体调节凋亡［19］ 。
本实验中,bad在退化期血管瘤呈高表达；bad在增生期血管瘤呈低表达；bad在正常皮肤组织呈低表达。经q检验，退化期组与增生期组之间、退化期组与正常皮肤组之间，bad的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05)。结果提示，bad基因通过诱导血管瘤内皮细胞的凋亡而促进血管瘤由增生向退化的转变。机体内细胞凋亡的调控是一个由多种分子参与的复杂,另外还有一些凋亡相关基因参与了血管瘤内皮细胞的凋亡调控，其具体机制有待进一步探讨。
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