脆性组氨酸三聚体基因在舌鳞状细胞癌中的表达及意义

              作者：张英怀, 王洁 , 董福生，谷建琦

【摘要】  目的 探讨脆性组氨酸三聚体基因在舌鳞状细胞癌中的表达及其意义。方法 应用免疫组化SP法检测30例舌鳞状细胞癌和12例正常舌粘膜鳞状上皮组织中FHIT的表达情况。结果 舌鳞状细胞癌组织中FHIT的阳性率（40.0%）显著低于正常舌粘膜组织（75.0%）（P<0.05）。FHIT的表达与年龄、性别无关(P>0.05)，而与分化程度相关，分化程度越低，FHIT的失表达越明显(P<0.05)。结论 FHIT可能在舌癌的发生中发挥重要作用。

【关键词】  脆性组氨酸三聚体；免疫组织化学；基因；舌癌

    The Expression and Significance of FHIT in Squamous Cell Carcinoma of Tongue

      Key words：Fragile histidine triad；Immunohistochemistry；Gene； Tongue cancer   

    舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，预后差，发病机制仍不清楚。脆性组氨酸三聚体(Fragile histidine triad，FHIT)基因是1996年分离出来的新的候选抑癌基因。许多研究都表明FHIT基因的缺失与众多肿瘤的发生发展密切相关。但FHIT和舌鳞状细胞癌的关系等相关研究国内鲜见报道，国外亦不多见。本研究采用免疫组化方法研究舌鳞状细胞癌中FHIT的表达及意义，探讨FHIT在舌鳞状细胞癌发生中的作用。

    1  资料与方法

    1.1  资料

    收集河北医科大学附属第二1991～2004年手术切除的舌鳞状细胞癌石蜡包埋组织标本30例。由2位高年病理医师复查全部病例所有病理切片，按WHO标准核实诊断， 全部病例均为鳞状细胞癌，高分化癌17 例，中分化癌7例，低分化癌6例。30例舌鳞状细胞癌患者中男19例，女11例，年龄28～79岁，平均年龄55.10岁；所有患者术前未经放疗及化疗。

    另外，取12例正常舌粘膜组织作为对照，其中男9例，女3例，年龄19～67岁，平均年龄44.17岁。正常组织均取自囊肿等良性肿瘤旁的正常舌粘膜，经病理证实为正常鳞状上皮组织。 

    1.2  试剂

    兔抗人FHIT多克隆抗体浓缩液，使用浓度1∶75, 二抗及SP免疫组化试剂盒，DAB显色剂，多聚赖氨酸防脱片剂均购自北京中山生物技术有限公司。

    1.3  对照实验

    用已知FHIT阳性的正常乳腺标本作为阳性对照。以PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.4  实验方法

    采用免疫组织化学SP法（过氧化物酶标记的链酶卵白素法）。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡重新包埋后，将每个蜡块切为4～5μm的切片，共切3张，1张FHIT染色，1张HE染色，1张作为阴性对照。石蜡切片常规脱蜡至水；3%  H2O2甲醇振洗25min，微波抗原修复，92℃～98℃×15min，正常山羊血清封闭，37℃孵育30min，滴加一抗，4℃过夜；滴加生物素化二抗。以上步骤均严格按照试剂盒要求操作。

    1.5  结果判定

    FHIT阳性结果判定： 以细胞核或浆内出现棕黄色颗粒者为阳性， 结果评定参照Van Heerden[1]标准， 采用半定量积分法， 即对每张切片的染色强度和染色范围分别进行分级计分， 然后根据二者之积确定其阳性强度。 染色强度为无染色或弱染色计为1分， 中等强度计为2分， 强染色计为3分； 染色范围以阳性细胞率计分： ＜10%为1分， 10%～50%为2分， ＞50%为3分。 二者得分计为1～9， ≤3分为不表达或弱表达（－）， ＞3分为中等或高表达（+）。

    1.6  统计分析

    用SPSS11.5统计软件进行统计分析，免疫组化结果用χ2检验，出现小值频数时，采用Fisher精确概率法。P＜0.05有统计学意义。

    2  结果

    2.1  FHIT蛋白在正常舌粘膜组织和舌鳞状细胞癌组织中的表达

    在正常舌粘膜组织中，FHIT蛋白的表达主要位于基底细胞层和棘层，也有少部分粒层出现FHIT蛋白的表达，呈棕黄色颗粒染色，且大多为强阳性染色，阳性细胞以上皮基底层较为密集，细胞核和细胞浆均有着色。在舌癌组织中FHIT蛋白的表达主要位于癌细胞的胞浆，呈黄色颗粒染色。

    FHIT蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的中等及高表达率为40.0%，明显低于对照组正常舌粘膜鳞状上皮组织（75.0%，P<0.05），见表1。

    2.2  FHIT蛋白的表达与临床病特征的关系

    FHIT蛋白的表达与患者的性别、年龄无明显的相关性（P>0.05），而与肿瘤的分化程度相关，分化程度越低，FHIT蛋白的表达缺失越明显（P<0.05），见表2。表1  FHIT蛋白在正常舌粘膜组织表2  舌鳞状细胞癌FHIT蛋白的表达

    3  讨论

    FHIT是1996年Ohta等用外显子捕获方法获得的新的候选抑癌基因，定位于染色体3p14.2，因其含有脆性位点FRA3B，具有不稳定性，故命名为脆性组氨酸三聚体。它是组氨酸三聚体基因家族的成员之一，含有10个外显子，其中外显子5～9组成开放阅读框架（ORF），编码147个氨基酸16.8KD的蛋白。FHIT蛋白是一种典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，可水解ApnA(n=3～6)成为ADP和AMP，Mn2+和Mg2+可刺激其活性，而Zn2+可抑制其活性。许多研究表明，在生理状态下，FHIT基因存在于大多数正常组织，而在多种肿瘤组织中如头颈癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等都有不同程度的减少甚至缺失，并发现与FHIT基因转录及缺失有关，包括等位基因的缺失、基因重排以及细胞基因的异常。有学者认为在人上皮性癌细胞中普遍存在FHIT基因杂合子和/或纯合子的缺失[2]。FHIT基因失活尤其发生在那些暴露于致癌环境而形成的上皮性来源的肿瘤中。本研究发现FHIT蛋白在正常舌粘膜的阳性表达率为75.0%，而且多为强阳性。在舌鳞状细胞癌中有60.0%存在FHIT蛋白的减少或缺失，这与以往口腔鳞状细胞癌的研究结果基本一致[3?7]。

    有研究发现，FHIT基因的低表达随着肿瘤分化程度的降低和淋巴结转移有增强趋势。也有研究表明，FHIT的表达与组织学分级及肿瘤的增殖活性成负相关，并且FHIT表达丢失的患者趋向于不良预后，即与短期生存率有关[8]。Lee等[3]对41例舌鳞状细胞癌标本的研究显示28例出现FHIT表达缺失（68%），而且FHIT表达缺失与疾病存活时间的长短呈显著相关性，与肿瘤大小和疾病所处阶段有关。本研究发现FHIT的失表达与舌鳞状细胞癌的病分级具有相关性(P＜0.05),而与患者的年龄、性别无关。

    本研究还发现，在正常舌粘膜组织中，FHIT蛋白表达于基底细胞和棘层细胞，而角化层及粒层基本无表达，这与 Van Heerden[1] 的初次研究结论不太一致。但后来该作者同样用免疫组化的方法以三种不同来源的FHIT抗体对正常口腔粘膜组织的表达进行比较，结果发现用Zymed GST?FHIT时在基底细胞和基底旁细胞强染色[7]，这与我们的研究结果一致，而KCC GST?FHIT则相反。说明用不同来源的抗体，FHIT蛋白的表达部位可能会有所不同，但在正常口腔粘膜（包括舌粘膜）的强阳性表达却都是一致的。

    本研究中还有少数几例正常舌粘膜出现FHIT蛋白的减少甚至缺失，可能与该基因的不稳定性及多态性有关，它们是否具备正常功能，目前还不清楚，有待于进一步探讨。

    关于FHIT的抑癌机制，可能以FHIT蛋白与其相互作用蛋白的结合为主，而以水解酶的作用次之[9?11]。FHIT在肿瘤发生中的作用尚不十分清楚，可能因其失活引起Ap3A或类似复合物在体内的积累，刺激DNA聚合酶ɑ合成DNA，使细胞通过细胞周期G1期控制点，进入S期，也可能因其失活后细胞对外界应激能力下降而发生恶性转化。

    综上所述，FHIT基因的改变可能在舌鳞状细胞癌的发生中发挥重要作用，FHIT的失表达可能是诊断舌鳞状细胞癌和判断其预后的一个有用指标。但FHIT在舌鳞状细胞癌发生中的机制及与其他诸多基因改变的复杂关系还需要进一步研究。

【】
  ［1］ Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. Immunohistochemical evaluation of FHIT protein expression in oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Pathol Med, 1999, 28(10):433?437．

［２］ Roce CM, Sozzi G, Huebner K. Role of FHIT in human cancer[J]. J Clin Oncology, 1999, 117(5): 1618?1624．

[３] Lee JI, Soria JC, Hassan K, et al. Loss of FHIT expression is a predictor of poor outcome in tongue cancer［J］. Cancer Res, 2001, 61(3):837?841．

［４］ Tanimoto K, Hayashi S, Tsuchiya E, et al. Abnormalities of the FHIT gene in human oral carcinogenesis［J］. British J Can, 2000, 82(4):838?843．

［５］ Uzawa N, Akanuma D, Negishi A, et al. Homozygous deletions on the short arm of chromosome 3 in human oral squamous cell carcinomas［J］. Oral Oncol, 2001, 37(4):351?356．

［６］ Chang KW, Kao SY, Tzeng RJ, et al. Multiple molecular alterations of FHIT in betel?associated oral carcinoma[J]. J Pathol, 2002, 196(3):300?306．

［７］ Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. FHIT protein expression in oral epithelium: immunohistochemical evaluation of three antisera［J］. Anticancer Res, 2001, 21(4A):2419?2423．

［８］ Yang Q, Yoshimura G, Suzuma T, et al. Clinicopathological significance of fragile histidine transcription protein expression in breast carcinoma［J］. Clin Cancer Res, 2001, 7(12):3869?3873．

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［１１］Otterson GA, Xiao GH, Geradts J, et al. Protein expression and functional analysis of the FHIT gene in human tumor cells［J］. J Natl Cancer Inst, 1998, 90(6):426?432．